Pesquisa de bacilo álcool ácido resistente – baar



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PESQUISA DE BACILO ÁLCOOL - ÁCIDO RESISTENTE – BAAR





  1. FUNDAMENTO

O diagnóstico das Micobactérias patogênicas (Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae), por bacterioscopia direta é feito através dos métodos de coloração de Ziehl-Neelsen e de Kinyoun, os quais utilizam a característica destas bactérias de possuírem paredes celulares com alto teor de lipídeos (cerca de 60%, principalmente de Ácido micólico), que quando tratadas pelo corante Fucsina fenicada, coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subseqüente por uma solução de Álcool-ácido forte (diferenciador). É por isto que são conhecidas por Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). As outras bactérias, que não possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos, têm a sua coloração pela Fucsina descorada pela solução de Álcool-ácido e coram-se em azul pela coloração de fundo do Azul de metileno (contra-corante).




  1. METODOLOGIAS DE COLORAÇÃO




    1. MÉTODO DE COLORAÇÃO À QUENTE – MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN




      1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;

      2. Deixar secar à temperatura ambiente;

      3. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;

      4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada, previamente filtrada ou filtrado sobre a lâmina no momento da coloração;

      5. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando algodão umedecido em álcool ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três emissões sucessivas. Evitar a fervura e secagem do corante (adicionar mais corante, se preciso, dentro deste período para evitar que a lâmina seque porque o esfregaço precisa estar coberto permanentemente durante o aquecimento.).  Este aquecimento deve ser intermitente, pois é importante manter a solução aquecida durante o tempo previsto;

      6. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda;

      7. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos;

      8. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado para não desprender a película;

      9. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;

      10. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da lâmina;

      11. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à temperatura ambiente ou estufa a 35º C;

      12. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).




    1. MÉTODO DE COLORAÇÃO À FRIO – MÉTODO DE KINYOUN




      1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;

      2. Deixar secar à temperatura ambiente;

      3. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;

      4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada (Kinyoun), previamente filtrada ou filtrado sobre as lâminas no momento da coloração, deixando agir por cerca de 5 minutos, adicionando mais corante se preciso dentro deste período, evitando que a lâmina seque;

      5. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda;

      6. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos;

      7. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado para não desprender a película;

      8. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;

      9. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da lâmina;

      10. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à temperatura ambiente ou estufa a 35º C;

      11. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).


Observação:

Na coloração do Mycobacterium leprae , segue-se o mesmo procedimento mas a descoloração deve ser feita com Ácido sulfúrico a 4% em água, pois esse microrganismo é sensível a descoloração alcoólica.

Ao realizar uma coloração de esfregaço, em qualquer método, alguns procedimentos devem ser observados a fim de evitar cometer erros por utilizar:


  1. substâncias corantes não certificadas;

  2. substâncias corantes precipitadas;

  3. corantes com concentração inadequada;

  4. esfregaços demasiados espessos, concentrados ou delgados;

  5. metodologia incorreta.




  1. TABELA DE INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO DA BACTERIOSCOPIA PARA BAAR:

A leitura deve ser feita no mínimo em cem campos microscópios, o que corresponde, aproximadamente, a leitura de uma linha reta que vai do extremo, onde está a numeração, até o extremo oposto, isso corresponde aproximadamente a mais ou menos 5 minutos de observação. Recomenda-se: um intervalo de 10 minutos de descanso para cada dez lâminas lidas e utilizar um desenho quadriculado para ir anotando o número de bacilos encontrados em cada campo microscópio e o resultado deve ser informado em número de cruzes segundo as normas do Ministério da Saúde em vigor.


Manual de Bacteriologia da Tuberculose – Ministério da Saúde / FNS / CENEPI / CNPS / Centro de Referência Prof. Hélio Fraga – 2ª Edição Revisada e Ampliada – 1994.


Número Total de Campos Observados

Número de bacilo álcool-ácido resistente observados por campo

Resultado

100

Não foram encontrados

Negativo

100

Menos de 1 BAAR por campo

Positivo (+)

50

De 1 a 10 BAAR por campo

Positivo (++)

20

Mais de 10 BAAR por campo

Positivo (+++)


Observação:

Nos casos de diagnóstico, ao encontrar de 1 a 4 bacilos em 100 campos observados, deve-se ampliar a leitura para mais 100 campos. Se a quantidade de bacilos encontrados depois de observar os 200 campos se mantiver entre 1 a 4 bacilos, informar o resultado como “NEGATIVO“ e solicitar nova amostra. Se nos materiais subseqüentes deste paciente persistir a negatividade, proceder a cultura.




  1. PREPARAÇÃO DOS CORANTES




    1. Corantes de Ziehl – Neelsen




      1. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen:




Fucsina básica

0.3g

Álcool etílico 95º %

10ml

Fenol fundido

5,75ml

Água destilada ou deionizada q.s.

100ml

Na preparação dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl – Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no Álcool etílico 95º, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma solução bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar após 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro.

Segundo Langeron, a prática seguida por outros autores de misturar a solução alcoólica saturada do corante com água fenolada não dá soluções tão estáveis e dotadas de poder corante tão intenso como esta técnica descrita acima.
Observação:

Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tomar-se-ão 5,75 ml ao invés de 5 ml.




      1. Álcool-Ácido:




Ácido clorídrico, densidade 1.19

3ml

Álcool etílico 95º %

97ml

Com uma pipeta deixar escorrer o Ácido clorídrico pelas paredes do frasco contendo o Álcool e agitar suavemente.


Observação:

Alguns autores recomendam Álcool-Ácido à 1%.




      1. Azul de metileno:




Azul de metileno

0.3g

Álcool etílico 95º %

3ml

Água destilada ou deionizada q.s.

100ml

Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar Água destilada ou deionizada até completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro.




    1. Corantes do método de Kinyoun:




      1. Fucsina fenicada de Kinyoun:




Fucsina básica

4g

Álcool etílico 95º %

20ml

Fenol fundido

9,75ml

Água destilada ou deionizada q.s.

100ml

Na preparação dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl – Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no Álcool etílico 95º, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma solução bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar após 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro.

Segundo Langeron, a prática seguida por outros autores de misturar a solução alcoólica saturada do corante com água fenolada não dá soluções tão estáveis e dotadas de poder corante tão intenso como esta técnica descrita acima.
Observação:

Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tornar-se-ão 9,75 ml ao invés de 9 ml.




      1. Álcool-Ácido:




Ácido clorídrico, densidade 1.19

3ml

Álcool etílico 95º %

97ml

Com uma pipeta deixar escorrer o Ácido clorídrico pelas paredes do frasco contendo o Álcool e agitar suavemente.




      1. Azul de metileno:




Azul de metileno

0.3g

Álcool etílico 95º %

3ml

Água destilada ou deionizada q.s.

100ml

Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar Água destilada ou deionizada quente até completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro.


Observação:

Para a coloração de fundo, outras soluções de Azul de metileno podem ser usadas, tais como a de Azul de metileno segundo Löeffler (Azul alcalino de Löeffler) e Azul de metileno segundo Kühne (Azul fenicado de Kühne).




    1. Azul de metileno segundo Löeffler (Azul alcalino de Löeffler):


Solução A:


Azul de metileno

0.3g

Álcool etílico 95º %

30ml

Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação.


Solução B:


Hidróxido de sódio 0,01 N

0,3ml

Água destilada ou deionizada q.s.

100ml

Dissolver o Hidróxido de sódio com Água destilada ou deionizada.


Solução C - para uso:
Misturar soluções A e B em partes iguais.
Observação:

Para o método de Ziehl-Neelsen, diluir na proporção de 1/10 com água destilada ou deionizada antes de usar.




    1. Azul de metileno segundo Kühne (Azul fenicado de Kühne):




Azul de metileno

1.5g

Álcool etílico 95º %

10ml

Fenol fundido

5,75ml

Água destilada ou deionizada q.s.

100ml

Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar o Fenol e Água destilada ou deionizada quente até completar o volume de 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro.


Observações:

  1. Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tomar-se-ão 5,75 ml ao invés de 5 ml.

  2. Para o método de Ziehl-Neelsen, diluir na proporção de 1/10 com água destilada ou deionizada antes de usar.




  1. CONTROLE DE QUALIDADE DOS CORANTES:

    1. Todos os corantes, preparados ou comprados prontos, utilizados no Laboratório Clínico, devem ser submetidos a um controle da qualidade, para a verificação do seu desempenho.

    2. Preparar uma suspensão de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 cultivando em tubo com meio de cultura 7H9. Fazer um esfregaço em uma lâmina com a suspensão e deixe secar ao ar. Deve-se preparar várias lâminas em câmaras de fluxo laminar e deixar estocadas em temperatura ambiente numa caixa fechada. Fixar e corar da mesma maneira que uma lâmina com amostra desconhecida. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão (100x). A micobactéria irá corar-se de vermelho, as demais bactérias e artefatos em azul.

    3. As lâminas estocadas e não coradas servirão como controle do desempenho para cada nova bateria de corantes e a cada semana de intervalo.

    4. Na falta de bactérias padronizadas, podem ser utilizadas as dos esfregaços enviados pelo Programa Nacional de Controle de Qualidade – PNCQ, ou solicitar nos Postos de Saúde dos Estado ou Municípios, os frascos utilizados para estocagem das Vacinas BCG, e, com as gotas restantes fazer o esfregaço para testar a qualidade do corante.




  1. CAUSAS DE ERROS NO EXAME MICROSCÓPIO DIRETO DE ESCARRO:

    1. Amostra insuficiente em quantidade e qualidade;

    2. Identificação inadequada no pote/frasco. Não deve colocar a identificação na tampa, e sim no corpo do pote/frasco;

    3. Área de trabalho inadequada ou mal iluminada;

    4. Troca das lâminas por falta de procedimento no trabalho;

    5. Processamento de uma série muito grande de amostras simultaneamente;

    6. Esquecer de misturar os escarros se as eliminações são poucas e se estão separadas dentro do pote/frasco;

    7. Esfregaços muito espessos ou muito delgados;

    8. Uso de lâminas arranhadas ou que tenham sido utilizadas anteriormente – podem simular bacilos pela deposição de corantes nas ranhuras;

    9. Fucsina seca e cristalizada no fundo do frasco. Deve-se usar Fucsina recentemente filtrada e colocada em frasco bem lavado;

    10. Descuido no aquecimento da Fucsina (método de Ziehl-Neelsen), permitindo que seque e cristalize no esfregaço;

    11. Descoramento insuficiente das lâminas pode deixar corados em vermelho outros bacilos, que assim confundem com o BAAR;

    12. Tempo de descoramento muito prolongado pode levar ao descoramento do BAAR;

    13. Não revisar a numeração das lâminas ou não identificar se apagar o número durante a coloração;

    14. Não limpar a lente de imersão depois de cada exame positivo;

    15. Existência de bacilos no óleo de imersão devido ao mau costume de tocar o esfregaço com o conta-gotas do frasco;

    16. Anotação errada do resultado na folha de trabalho diário;

    17. Transcrição errada da planilha de trabalho diário para o impresso a ser fornecido ao setor de laudo.



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