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Seis Anos de Citometria de Fluxo no INCA



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Seis Anos de Citometria de Fluxo no INCA

Sérgio Dalmau – Instituto Nacional do Câncer, Rio de Janeiro, RJ.


A implantação da Citometria de Fluxo no INCA, mais precisamente no Hospital de Câncer, tem como marco o início da década de 90. Naquela época, alguns dos pesquisadores do Serviço de Pesquisa Básica, entre os quais me incluo, recorrem ao Dr. Álvaro L. Bertho, então operador do citômetro no Laboratório do Dr Sérgio G. Coutinho (FIOCRUZ, RJ), para leituras de materiais fixados. É consenso entre os pesquisadores do Núcleo de Imunologia da Pesquisa Básica a necessidade de um citômetro no Serviço: a introdução no mercado de um sem-número de anticorpos monoclonais para marcadores de superfície e o “boom” da redescoberta da apoptose e suas técnicas de detecção/quantificação envolvem os citômetros de fluxo em praticamente todas as publicações internacionais de Imunologia e Hematologia. Contudo, na época, as palavras citômetro de fluxo, anticorpo monoclonal, oncogene, etc., são, de maneira geral, alienígenas para os médicos do INCA. Apenas alguns hematologistas procuram seu significado. Assim, a aquisição de uma “máquina cara” em época de crise inflacionária, e para uma Pesquisa que não traz soluções aos anseios imediatos dos médicos, é vista como mais uma excentricidade de cientista.

Em 1991, a Dra Vivian Rumjanek, à frente da Coordenadoria de Pesquisa do INCA, com um coro endossado pela Dra Maria Socorro P. Correia, hematologista desta Instituição recém-chegada da Europa, e pelo grupo de sorotipagem de HLA do Hospital dos Servidores do Estado (HSE), braço importante para o Centro de Transplantes de Medula Óssea (CEMO) do INCA, obtém promessa do então atual Diretor do INCA da compra de dois FACS (fluorescence activated cell sorter): um para o INCA, o outro para o HSE. A promessa se reduz a um único aparelho, o do INCA. Posteriormente se reduz ainda mais, para um citômetro de fluxo (i.e., sem “sorter”). Faço parte dos 4 votos para a escolha da marca, e fico como responsável pelo processos de instalação e do aprendizado de operação do mesmo. Do primeiro, participa também a Dra Maria José de Andrada Serpa, então chefe do Serviço de Pesquisa Básica.

Avaliadas as dificuldades de instalação e os riscos com manutenção dos aparelhos na época (i.e., refrigeração água x ar, número de aparelhos que a firma já atendia no Rio, sede da firma e disponibilidade dos técnicos a curto prazo, estoque de peças) opta-se pelo FACSAN II da B & D. Problemas como refrigeração adequada e circuito elétrico independente são resolvidos pelos técnicos da Ambriex e o Setor de Manutenção do INCA. Um “no brake” adequado continuaria até hoje no sonho. O citômetro chega em meados de 1992. Invisto no aprendizado autodidata para deixar questões mais complexas para um curso que o operador responsável teria direito na matriz (EUA). Por motivo que não cabe aqui citar tal curso nunca se materializou. Enquanto isso, o Diretor do INCA cobra pelos corredores o quê a “Máquina de Video-Game” da Pesquisa já faz. Nesse ínterim, são aprimoradas as marcações triplas de superfície excluindo células mortas, padronizada a técnica de “fine needle aspiration” para a análise de ploidia em tumores sólidos, e feitas as primeiras leituras de extrusão de rodamina 123 para medição de atividade “multiple drug resistance” em células tumorais. São feitas também as primeiras fenotipagens de leucemias.

Nessa época, médicos do INCA descobrem que a análise de ploidia estava em moda e afluem no propósito de realizar estudos nas suas especialidades. Ignoram contudo, o tempo de preparação das amostras. Pesquisadores de outras instituições vem no citômetro no INCA uma alternativa para a leitura de seus experimentos e para lá começavam a fluir. Por duas vezes o aparelho é encontrado abandonado ligado por pessoas autorizadas a manipulá-lo. O Citômetro assume importância: há a necessidade de contratação de um técnico para operá-lo.

Outra via crucis. Curiosamente, a maior parte dos 5 componentes de um Comitê Interno de Pesquisa do INCA para discutir a contratação de um operador exclusivo para o citômetro se opõe a mesma. As alegações são de que “no exterior cada um opera ele mesmo a máquina” ou “eu sou contra porque eu mesmo sei operar a máquina”. Sabiamente, o então Diretor do Hospital de Câncer, Jacó Kriegerman, que presidia a reunião, e que já lia sobre câmbios de ploidia em tumores da sua especialidade, ouviu minhas ponderações, encaminhando o pedido de contratação. De início busca-se uma pessoa com boa noção de informática e eletro/eletrônica já que a manutenção era uma incógnita: mais de meio ano findo o prazo de garantia, o montante e a sazonalidade na liberação de recursos para um primeiro contrato de manutenção anual ainda eram discutidos com o representante. Nossa pretensão esbarra na sua falta de dedicação do técnico ao aparelho e seu desinteresse por fenômenos biológicos. Passamos então a tentar a contratação de um biólogo que estivesse disposto a se dedicar exclusivamente ao aparelho. Este faria parte também de um projeto multidisciplinar de câncer de mama coordenado pela Dra Maria José Andrada Serpa e do qual eu também fazia parte. Esta contratação seria viabilizada pela então recém criada Fundação Ari Frauzino. Apenas 2 pessoas se candidatam, somente uma com disposição exclusiva ao FACS. Oito meses ainda se passam até sua real contratação. Estamos no 2o trimestre de 1993. Nesse intervalo, os fundamentos de citometria, os princípios dos programas usados para aquisição e análise, e as técnicas até então por mim estabelecidas, acima citadas, são a ela passados. Hoje, salvo raros usuários introduzidos na manipulação do aparelho no INCA, a bióloga Ramza Cabral Harab opera o aparelho que serve às rotinas de fenotipagem de leucemias da Hematologia, acompanhamento pré- e pós-transplante de CEMO, aos projetos de pesquisa básica isolados ou integrados ao corpo clínico do INCA e a pesquisadores de outras instituições.

A locação adequada, a dificuldade de acesso ao aparelho de pessoas pouco capacitadas à sua manipulação e uma manutenção interna e externa responsável devem explicar o porque do citômetro do INCA só haver estado fora de funcionamento uma vez (2 meses) desde a sua instalação. Para isto sempre contamos com o espírito profissional de Alexandre Martins, engenheiro eletrônico da Ambriex, responsável pela instalação e manutenção do citômetro, sempre apto a responder a nossa solicitação em tempo hábil. Por mais de uma vez recorremos à sua ajuda para sanar problemas no aparelho em épocas em que o INCA estava inadimplente com o contrato de manutenção ou protelava sua renovação.

A introdução do Núcleo de Citometria no INCA, foi com certeza foi o passo que mais contribuiu para um início de interação entre as pesquisas básica e clínica no INCA. Não nos deixam mentir os projetos nas áreas de câncer mama, de pênis, e resistência a drogas em leucemias. Some-se a isto a rotina de tipagem de leucemias. Desde a sua introdução até meados de 1998, o Citômetro esteve envolvido em cerca de 20 publicações internacionais, e pelo menos 7 teses de mestrado ou doutorado orientadas e ou executadas pelo “staff” do INCA. Baseado no levantamento de publicações efetuado pela Coordenadoria de Pesquisa do INCA, isto corresponde a pelo menos 1/3 das publicações indexadas (Current Contents). Este valor embora pequeno é bastante significativo, se posto que o INCA é um órgão primordialmente assistencial. Por outro lado, embora não tenhamos estatística, acreditamos que o Núcleo de Citometria do INCA tenha contribuído com igual número de publicações para outras Instituições de Pesquisa.

Mesa Redonda 2 – Citometria de Fluxo no Estudo das Citocinas

The Use of Flow Cytometry for Analysis of Immune Function: Cytokine Production, T Cell Repertoire , and Lymphocyte Activation.

Kenneth J. Gollob Depto. de Bioquímica-Imunologia, Laboratório de Biologia de Linfócitos - UFMG-ICB, Belo Horizonte , MG.


Since the advent of fluorescent activated flow cytometric analysis and sorting (flow cytometry) by Len Herzenberg, Stanford University it has become a key tool in the discovery of mechanisms involved in several immunologic processes. Included are studies using flow cytometry for the analysis of cell cycle, activation, differentiation, tolerance induction, development, and phenotyping analysis. Additionally, the use of flow cytometry has been key in cloning of new molecules and separation of subpopulations of cells for detailed studies of structure and function.

We have been using flow cytometry for analysis of immune function since 1987. We began using flow cytometry to study T cell repertoire during my doctorate studies at National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine, Denver, CO. The use of flow cytometry in these studies allowed us to determine the specificity of retroviral superantigens, and aided in the mapping of the loci encoding these genes (1-3). Following these studies, we made use of much more sophisticated flow cytometry techniques during my postdoctoral research at DNAX Research Institute, Palo Alto, CA. In these studies we used flow cytometry to determine the role of CD4+ T lymphocyte subpopulation interactions in Th1 and Th2 development (4,5). In these studies we used flow cytometry for critical immune-phenotyping as well as for physical separation of cell populations. The use of a sorter allowed us to obtain populations of > 99% purity from whole splenic lymphocytes. Finally, we used flow cytometry to aid in studies concerning T cell activation via IFN- receptors (6). In all of these studies, the capacity of flow cytometry to analyze large numbers of events and return data demonstrating the frequency of events positive for the given marker, as well as the capacity to separate and purify cell populations has made it a necessary tool in many studies.



Over the past few years, here in Brazil, we have continued to use flow cytometry to study the role of T cells and cytokines in the development of human parasitic diseases (schistosomiasis (7,8) and leishmania). The goal of these studies has been to determine which key regulatory cytokines are associated with which clinical forms of disease, and what are the cellular sources of these cytokines. Dr. Walderez O. Dutra (UFMG-ICB, Department of Morphology) and myself invested in a collaboration with Dr. Hans Yssel at DNAX Research Institute (currently at INSERM, France) to learn and use the technique of single cell cytoplasmic staining of cytokines for studies of human parasitic diseases. After this training in 1995, we brought this technology back to Brazil and have been using it in several projects in our labs. Moreover, the determination of differences in the cellular responses (T cell repertoire, cytokine profiles, activation state, and immune phenotyping) using flow cytometry will allow us to plan better new approaches for treatments and vaccines, as well as add to our basic understanding of the underlying mechanisms involved in the development of human parasitic diseases. Our data concerning these studies in the areas of human schistosomiasis and leishmaniasis has been promising, and indicates the usefulness of these approaches for future projects. We have identified cell populations producing a variety of key cytokines in these diseases using flow cytometry analysis as well as performed immune phenotyping related to stimulation with a variety of antigens from these two diseases. (The above mentioned studies have been, and are being, carried out with a number of colaborators including Drs. Barral-Netto, M., Barral, A., Carvalho, E., Colley, D., Coffman, R.L., Correa-Oliveira, R., Dunne, D., Dutra, W.O., Gazzinelli, G., and Yssel, H.).

1. Gollob, K.J. and Palmer, E. (1992) Divergent viral superantigens delete V5+ T lymphocytes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:5138-5141. 2. Woodland, D.L., Happ, M.P., Gollob, K.J. and Palmer, E. (1991) An endogenous retrovirus mediating deletion of / T cells? Nature 349:529-530., 3. Gollob, K.J. and Palmer, E. (1993) Aberrant induction of T cell tolerance in B cell suppressed mice. J.Immunol. 150:3705-3712., 4. Gollob, K.J. and Coffman, R.L. (1994) A minority subpopulation of CD4+ T cells directs the development of naive CD4+ T cells into IL-4 secreting cells. J.Immunol. 152:5180-5188., 5. Gollob, K.J., Dutra, W.O., and Coffman, R.L. (1996) Early message expression of IL-4 and IFN-, but not of IL-2 and IL-10, reflects later polarization of primary CD4+ T cell cultures. Eur. J. Immunol .26:1565-1570. 6. Pernis, A., Sanjay,G., Gollob, K.J., Garfein, E., Coffman, R.L., Chris Schindler, and Rothman, P. (1995) Lack of interferon- receptor  chain prevents interferon- signaling in TH1 cells. Science 269: 245-247. 7. Rezende, S.A., Gollob, K.J., Correa-Oliveira, R., and Goes, A.M. (1998) Down modulation of MHC surface molecules on B cells by suppressive immune complexes obtained from chronic intestinal schistosomiasis patients. In Press Immunology Letters., 8. Dutra, W.O., Correa-Oliveira, R., Dunne, D., Fonseca, L., Fraga, L., Prata, A., Roberts, M., Silveira, A.M., Webster, M., Yssel, H. and Gollob, K.J. (1998) Ex vivo immunologic profile of IgE high and low responder schistosomiasis patients. Em preparação.

Avaliação de Citocinas Intracitoplasmáticas em Células Mononucleares do Sangue Periférico de Pacientes Chagásicos após Estimulação in vitro com Antígenos Derivados do Trypanosoma cruzi

Gomes, J. A . S.1,2; Bahia- Oliveira, L.M.G.3; Rocha, M. O . C.4; Martins- Filho, O . A 1.; Gazzinelli, G.1; & Correa-Oliveira, R 1. 1-Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG; 2-Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG; 3-Laboratório de Biologia do Reconhecer, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytagazes, RJ; 4-Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG


A doença de Chagas, infecção parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi, representa uma das principais endemias da América Latina, afetando cerca de 16 milhões de indivíduos (WHO, 1995). Após a infecção, os parasitas são capazes de sobreviver e replicar em uma variedade de células nucleadas, incluindo macrófagos.

A replicação do parasita nos macrófagos é aparentemente regulada por citocinas, que afetam, não apenas o desenvolvimento da infecção, mas também a morbidade da doença. Dentre as citocinas estudadas, o IFN-gama tem sido associado a resistência do hospedeiro à infecção durante a fase aguda (Silva et al., 1992; Samudio et al., 1998 ). Em modelos experimentais, na fase aguda da infecção pelo T. cruzi, a administração de IFN-gama tem efeito protetor; já sua neutralização resulta em aumento da susceptibilidade. A produção dessa citocina, no início da infecção, diminui a mortalidade dos animais infectados apesar de não eliminar a infecção (Silva et al., 1992; Minoprio et al., 1993; Cardillo et al., 1996). Nessa fase, a principal fonte de produção de IFN-gama é a célula NK; a produção de IFN-gama por linfócitos T ocorre só tardiamente. Outras citocinas, como IL-10 e TGF-beta, estão associadas a susceptibilidade à infecção pelo T. cruzi (Silva et al., 1992; 1991), devido, provavelmente, a seu papel inibidor da atividade de IFN-gama. Reed e cols. (1988) e Cardillo e cols. (1996) mostraram que a produção de IFN-gama por células mononucleares, induzida pelo T. cruzi in vitro ou in vivo, seria regulada pela IL-10, sugerindo que a maior ou menor resistência observada na fase inicial da infecção (fase aguda) poderia ser uma consequência do balanço IFN-gama / IL-10 (Silva et al., 1998).

Na fase crônica da doença, a análise ex vivo de mRNA de várias citocinas em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes chagásicos apresentou uma alta expressão de mRNA para IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-gama (Dutra et al., 1996). Quando essas células foram estimuladas por antígenos derivados do T. cruzi, observou-se uma forte expressão de mRNA para IFN-gama e fraca de mRNA para IL-10. Por outro lado, a estimulação por anticorpos anti-epimastigotas (idiotipos) produziu resultados opostos, com forte expressão de mRNA para IL-10 e fraca de mRNA para IFN-gama. Já ao nível do infiltrado inflamatório do coração de pacientes chagásicos cardíacos, constatou-se produção significativa de IFN-gama e TNF-alfa (Cunha-Neto et al., 1998).

Numa tentativa de correlacionar o papel dessas citocinas com a patologia da doença, nosso laboratório vem estudando a produção de citocinas por PBMC de pacientes chagásicos nas formas clínicas Indeterminada e Cardíaca. Inicialmente avaliamos a secreção de citocinas, analisando o sobrenadante de culturas de células estimuladas in vitro com antígenos do parasita. Os níveis de IL-10 e IFN-gama produzidos não diferiam estatisticamente entre os grupos de pacientes das duas formas clínicas. Entretanto, a análise individual dos níveis de IFN-gama secretados por PBMC desses pacientes, possibilitou a sua divisão em dois grupos: altos produtores (> 5ng/ml) e baixos produtores (< 4.9 ng/ml). A percentagem de altos produtores foi maior nos pacientes do grupo de cardíacos (83%) quando comparada com a do grupo de indeterminados (49%), sugerindo uma associação entre produção de IFN-gama e morbidade na doença de Chagas. Por outro lado, o nível de secreção de IL-10, após estimulação específica de PBMC desses mesmos indivíduos, foi o inverso da produção de IFN-gama (Bahia- Oliveira et al., 1998).

A fim de tornar mais consistente a nossa hipótese de uma possível associação entre IFN-gama e a patologia cardíaca, o grupo de pacientes cardíacos foi subdividido, de acordo com sinais e sintomas clínicos, em leve, moderado e grave. Observou-se que PBMC desses sub-grupos de pacientes, após estimulação in vitro, produziam níveis crescentes de IFN-gama que coincidiam com a severidade da cardiopatia (Bahia-Oliveira et al., manuscrito em preparação).

Com a finalidade de identificar as principais subpopulações celulares produtoras de citocinas na doença de Chagas, utilizamos da citometria de fluxo. PBMC de pacientes chagásicos crônicos, das formas clínicas indeterminada ou cardíaca, foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 5% de soro AB humano, em placas de 24 poços ou tubos de polipropileno (1 X 10 6/ml) por tempo variável, a 37 oC e 5% de CO2, em presença de antígenos preparados das formas Epimastigota (25ug/ml) e Tripomastigota (20ug/ml), de PMA (10ng/ml) e Ionomicina (1ug/ml), e de SEB (0.5ug/ml). Brefeldin A (10ug/ml) era adicionada 6 a 10 horas antes do final da cultura como descrito por Jung e cols. (1993). Finalmente, as células eram lavadas com solução salina (PBS)/ 1% de soro fetal bovino e marcadas com as seguintes combinações de anticorpos monoclonais: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD16, -CD56, -CD19, -CD14, -TCR alfa/beta e -TCR gama /delta. Após fixação e permeabilização com formaldeído (4%) e solução de saponina (0.5%), as células eram incubadas com anticorpos monoclonais anti-IL-10 ou anti-IFN-gama. Um mínimo de 50.000 eventos eram analisados nas populações de pequenos linfócitos e células blásticas. Primeiramente, determinamos a cinética de produção de IL-10 e IFN-gama em PBMC de 5 pacientes chagásicos, estimuladas com antígenos do parasita, por 6, 8, 12, 18 e 24 horas e do 2o ao 6o dias de cultura. Observou-se que o pico de produção de IL-10 foi em torno de 24 horas após estimulação enquanto a produção de IFN-gama foi maior no 6o dia de cultura. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por nós nos ensaios de ELISA acima mencionados. A partir desses resultados passamos a investigar a produção de IL-10 no 1o dia e IFN-gama no 6o dia de cultura. Nossos dados são preliminares e mostram, até o presente momento, que a maioria das células produtoras de IL-10 são CD14+, enquanto a maioria das células produtoras de IFN-gama são CD3+, tanto gama delta quanto alfa beta, sendo que pacientes da forma clínica cardíaca apresentam percentuais mais elevados dessa citocina. O percentual de produção de ambas as citocinas foi maior na população de células blásticas em relação a população de pequenos linfócitos.

Em conclusão: ao contrário do que ocorre na fase aguda da doença de Chagas experimental e humana, em que IFN-gama está relacionado com a destruição do parasita, nossos dados sugerem fortemente uma associação da produção de IFN-gama por linfócitos CD3+ e morbidade na doença de Chagas crônica. Nossos estudos sugerem ainda que, provavelmente, IL-10 é um componente importante na regulação de IFN-gama nessa doença, participando, também, por conseguinte, na imunopatologia da doença crônica. A nossa hipótese para futuras investigações é de que os níveis de produção de IFN-gama e IL-10 seriam preditivos da evolução clínica da doença.

Apoio financeiro: CNPq, NIH - AI 26505 e PAPES/FIOCRUZ

Referências Bibliográficas

Bahia-Oliveira, L.M.G.; Gomes, J.A.S.; Rocha, M.O.C.; Moreira, M.C.V.; Lemos, E.M.; Luz, Z.M.P.; Pereira, M.E.S.; Coffman, R.L.; Dias, J.C.P.; Cançado, J.R.; Gazzinelli, G. & Correa-Oliveira (1998). IFN-gamma in human Chagas’disease: protection and pathology? Braz. J. Med. Biol. Res. 31:127.

Cardillo, F., Voltarelli, J., Reed, S.G & Silva, J.S. (1996). Regulation of Trypanosoma cruzi infection in mice by gamma interferon and interleukin-10. Role of NK cells. Infect. Immun. 64(1): 128.

Cunha-Neto, E.; Rizzo, L.V.; Albuquerque, F.; Abel, L.; Guilherme, L.; Bocchi, E.; Bacal, Carrara, D.; Ianni, B.; Mady, C. & Kalil, J. (1998). Cytokine production profile of heart-infiltrating T cells in Chagas’disease cardiomiopathy . Braz. J.Med. Biol. Res. 31:133.

Dutra, W.O., Gollob, K.J., Barcomb-Caddle, L., Dias, J.C.P., Gazzinelli, G., Correa-Oliveira, R; Coffman, R.L. & Carvalho-Parra, J.F. (1996b). Cytokine mRNA profile of peripheral blood mononuclear cells isolated from individuals with Trypanosoma cruzi chronic infection. Scand. J. Immunol. 44,

Jung, T.; Schauer, U.; Heusser, C.; Neumann, C. & Rieger,C. (1993). Dectition of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immuno. Meth, 159 : 197.

Minoprio, P., El Cheikh, M.C., Murphy, E., Hontebeyrie-Joskowicz, M., Coffman, R.L., Coutinho, A. & O’Garra, A. (1993) Polyclonal lymphocyte responses to murine Trypanosoma cruzi infection. Quantitation of both T and B-cell responses. Scand. J. Immunol. 24,661.

Reed, S.G (1988). In vivo administration of recombinant IFN- induces macrophage activation, and prevents acute disease, immune supression, and death in experimental Trypanosoma cruzi infection. J. Immunol, 140: 4342.

Samudio, M.; Motenegro-James, S.; Cabral, M.; Martinez, J.; Rojas de Arias, A. & James, M.A. (1998). Cytokine responses in Trypanosoma cruzi-infected children in Paraguay. Am. J. trop. Med. Hyg. 58(1): 119.

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Silva, J.S., Morriessey, P.J., Grabstein, K.H., Mohler, K.M., Anderson, D. & Reed, S.G. (1992). Interleukin 10 and interferon gamma regulation of experimental Trypanosoma cruzi infection. J. Exp. Med 175, 169.

Silva, J.S.; Aliberti, J.C.S.; Martins, G.A.; Souza, M.A.; Souto, J.T. & Pádua, M.A. (1998). The role of IL-12 in experimental Trypanosoma cruzi infection. Braz. J .Med. Biol. Res. 31:111.



World Heath Organization (1995). Tropical Disease Research: Progress 1975-94: Highlits 1993-94: Twelfth programme Report of the UNDP/World bank/WHO Special Programme for research and training i tropical disease (TDR). Geneva:WHO,125.

Mesa Redonda 3 – Receptores de Membrana

Detecção de Ligantes e Receptores de Matriz Extracelular em Células Epiteliais Tímicas: Estudo Citofluorimétrico

Wilson Savino

Laboratório de Pesquisas sobre o Timo, Departamento de Imunologia, Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ

Nos últimos anos, acumulamos uma série de evidências mostrando que células epiteliais tímicas (TEC), o principal componente do microambiente tímico, e responsável por guiar diversos eventos no processo de diferenciação intratímica de linfócitos T, são capazes de produzir componentes de matriz extracelular (ECM). Além disso, mais recentemente evidenciamos que eventos de adesão entre timócitos e TEC são dependentes de proteínas de ECM tais como fibronectina, laminina e colágeno tipo IV. Finalmente, observamos por imunocitoquímica que a densidade de ligantes e receptores de ECM pode ser modulada em algumas situações experimentais, incluindo estímulos hormonais e mesmo agentes infecciosos.

Mais recentemente, iniciamos análise citofluorimétrica de ligantes e receptores de matriz extracelular expressos por TEC in vitro, visando a poder quantificar variações de densidade de diferentes proteínas de ECM na superfície dessas células. De fato, conseguimos detectar marcação específica para fibronectina, laminina e seus respectivos receptores VLA-5 e VLA-6. A dificuldade que vimos encontrando situa-se essencialmente no fato de que para conseguir suspensões celulares de TEC, é necessário tratamento enzimático, o que provoca perda de matriz na superfície das TEC, prejudicando sua detecção por citofluorimetria. Ainda assim, conseguimos definir modulação de proteínas de ECM tais como fibronectina, laminina e colágeno tipo IV, após tratamento hormonal. Conforme já esperávamos, a detecção citofluorimétrica de receptores de ECM é menos prejudicada pelo tratamento enzimático (o que pode ser visto pela homogeneidade dos perfis citofluorimétricos obtidos), e sua modulação a também pode quantificada após tratamento hormonal.

Em conclusão, apesar de ainda serem necessárias algumas modificações metodológicas, já podemos quantificar aquela matriz extracelular que se situa justaposta à membrana plasmática das TEC, e que deve ser a responsável pela ligação com linfócitos tímicos. Além disso, a densidade dos receptores de tais moléculas de ECM, e que também são constitutivamente expressos pelas TEC, pode ser definida por citofluorimetria.



A Citometria de Fluxo como Instrumento de Estudo da Expressão e da Modulação de Receptores e Ligantes de Superfície.

Tânia C. de Araújo-Jorge - Lab. de Biologia Celular, Depto. de Ultra-estrutura e Biologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ.


Nosso laboratório estuda os processos de reconhecimento que levam à interação entre células, tais como parasitas e células hospedeiras, ou células do sistema imune e seus diferentes alvos. A citometria de fluxo se tornou um instrumento poderoso para nós desde que fomos introduzidos à ela em 1989, pelas mãos dos Profs. Marc Daëron (Inst. Curie, France) e Oberdan Leo (Université Libre de Bruxelles, Belgique). Nessa rápida revisão, faremos referência aos estudos que temos feito desde então nessa linha de investigação.

Iniciamos através do estudo da expressão de receptores para a porção Fc de IgG, do tipo FcRII e FcRIII. O anticorpo monoclonal (mAb) 2.4G2 reconhece um epítopo na porção extracelular que é comum a estes dois receptores e, além da ligação, este mAb também tem atividade agonista, ou seja dispara os efeitos do receptor após a ligação na células que os expressem. Por imunocitoquímica indireta em citometria de fluxo demonstramos que a expressão destes receptores aumenta em linfócitos de camundongos infectados por T. cruzi, durante a fase aguda da infecção experimental (Araújo-Jorge e cols. 1993, Parasite Immunol. 15: 539-546). Para abordar as possíveis funções in vivo destes receptores, estudamos o efeito da injeção deste mAb em animais normais e infectados (Araújo-Jorge e cols.1993, Inf. Immun. 61: 4925-4928). A primeira questão a ser respondida era qual a velocidade com que o mAb atingia os diversos tecidos após ima injeção intra-peritoneal e quanto tempo durava a sua ação. Para isso injetamos 2.4G2 na cavidade peritoneal de animais normais e acompanhamos a presença in vivo do mAb nas células peritoneais (local de injeção), dos gânglios mesentéricos e do baço (órgãos linfoides aos quais o mAb teve acesso através da circulação), e no sangue, através da possível ligação de 2.4G2 do plasma sobre uma linhagem celular que expressa FcRII/III (P815). Após a coleta as células era incubadas apenas com o conjugado anti-IgG de rato-FITC, para revelar o mAB ligado in vivo, ou então com 2.4G2 e anti-rato, para revelar os receptores livres. Nunca conseguimos evidenciar o 2.4G2 na circulação, uma vez que ele apresenta uma afinidade enorme pelos receptores celulares, mas verificamos que o mAb alcançava os outros órgãos além do peritoneo, e que em 4 dias ainda havia 2.4G2 ligado em receptores de superfície nas células obtidas das 3 fontes. Isso foi decisivo para a definição do protocolo de injeção para estudo do efeito do mAb a longo prazo, pois re-injetamos então os animais a cada 4 dias, durante 21 dias. Verificamos que esse tratamento protegia os animais, que apresentaram menor parasitemia e mortalidade do que controles injetados com um mAb de mesmo isotipo, porém não ativo.

Expandimos depois nossos estudos para outros receptores e epítopos que funcionam como marcadores fenotípicos em macrófagos: (a) FcRI, receptor Fc de alta afinidade para IgG, revelado pelo ligante fluoresceinado, (b) CR3, uma 2-integrina reconhecida pelo mAb M1/70, (c) o antigeno de 160 KDa reconhecido pelo mAb F4/80, e (d) o A2MR/LRP, receptor para alfa-2-macroglobulina complexada a proteases, reconhecido pelo próprio ligante fluoresceinado. Estudamos também a expressão de ligantes glicosilados, através da ligação de lectinas fluorescentes com especificidades para diferentes carbohidratos (DaMatta e cols. 1995, Tissue & Cell 27:505-513). Com essa abordagem demonstramos que entre os macrófagos peritoneais há uma heterogeneidade referente à células em diferentes estágios de maturação, apresentando as mais maduras as seguintes características: menor densidade, maior diâmetro, maiores valores de dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC) da luz em citometria, maior intensidade de ligação de F4/80, maior expressão de CR3, FcRI e FcRII/III, maior grau de sialilação e menor exposição de resíduos de -galactose, menor expressão de resíduos de manose e maior de N-acetil-galactosamina.

Os receptores para alfa-2-macroglobulina complexada a proteases (A2M-F) foram alvos especiais de nossa atenção, tendo em vista a possível participação desta proteína plasmática na resistência de camundongos à doença de Chagas experimental. Fluoresceinamos A2M para usá-la como indicador da presença do receptor e estudamos sua expressão em macrófagos de animais C57BL6 e C3H, que quando infectados apresentavam cinéticas de modulação dos níveis plasmáticos de A2M diferentes (Coutinho e cols. 1998, Tissue&Cell, in press). Analisamos as condições de ligação quanto à dose-dependência, sensibilidade à pH e presença de cálcio, e quantificamos a intensidade de expressão do receptor, mostrando que são mais expressos em camundongos C57BL6 do que em C3H, e que dobram sua expressão nos animais infectados. Após verificarmos que A2M se ligava também na superfície do Trypanosoma cruzi, estudamos se essa ligação poderia se dar por meio de um receptor semelhante ao descrito em mamíferos. Confirmamos essa hipótese, demonstrando a presença de um sistema receptor para A2M-protease em T. cruzi, com características funcionais semelhantes às encontradas em macrófagos (Coutinho e cols. 1997, Parasitol. Res. 83:144-150).

Utilizando a citometria de fluxo também demonstramos na superfície do T. cruzi a presença de uma molécula semelhante à proteína C reativa humana (Coutinho e cols. 1998, Exp. Parasitol. , in press). Estudos de ligação de anticorpos poli- e monoclonais anti-CRP humana à superficie de epi e tripomastigotas de T. cruzi foram feitos, mostrando situações de competição ou não entre anticorpos pela ligação num mesmo epitopo dessa molécula.

Finalmente, temos utilizado a citometria de fluxo como instrumento de análise qualitativa e quantitativa da presença de anticorpos dirigidos a epítopos expressos apenas em tripomastigotas vivos, os chamados anticorpos líticos. Temos também utilizado o aparelho para discriminar morfologicamente epi- ama- e tripomastigotas, estudar aspectos de diferenciação que ocorrem durante a transformação de um estágio evolutivo em outro. O padrão de glicosilação e de sialilação de superfície nos parasitas pode ser bem explorado com esta abordagem.

Em suma, a citometria de fluxo tem sido de extrema utilidade nos projetos de pesquisa desenvolvidos no LBC-DUBC, sendo complementar à microscopia ótica e eletrônica e permitindo análises dinâmicas de processos os mais variados. Por conta destes aspectos, temos nos engajado firmemente na formação de recursos humanos para operar o citômetro disponível no laboratório, bem como para interpretar os dados gerados, em unidades de análise remotas. A organização do Programa Integrado de Citometria de Fluxo da FIOCRUZ foi um passo que nos permitiu sistematizar essa atividade docente em disciplinas bem categorizadas e regularmente oferecidas. Temos tido um retorno extremamente positivo dos alunos que participam destes cursos.

A Citometria de Fluxo no LIMI (Cpqgm/Salvador, Ba)

Theolis Barbosa; J. Andrade, Aldina Barral. - Lab. de Imuno-regulação e Microbiologia -CPqGM/FIOCRUZ, Salvador, BA


Em nosso laboratório, a citometria de fluxo tem sido utilizada para investigar o comportamento de moléculas de superfície e outros parâmetros associados à ativação/anergia de células do sistema imune, com a identificação simultânea das subpopulações celulares envolvidas. Três das nossas linhas de pesquisa incluem a citometria de fluxo entre seus métodos de análise: o estudo da leishmaniose e da tuberculose humanas, e a avaliação do potencial estimulatório de lectinas, substâncias com atividade imuno-modulatória.

Marcação de moléculas de superfície. Para a distinção de subpopulações celulares, principalmente de linfócitos, e avaliação de sua representatividade, fazemos a análise da expressão de moléculas de superfície (CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD19, CD56, TCR/) em amostras de sangue periférico de pacientes com leishmaniose visceral, cutânea e mucocutânea, em amostras de punção de linfonodo de pacientes com leishmaniose cutânea e no sangue e líquido pleural de pacientes com pleurite tuberculosa. Não existem estudos utilizando painéis extensos para a avaliação de subpopulações linfocitárias em leishmaniose e em tuberculose, e nós temos interesse em verificar a expansão de subconjuntos particulares (especialmente de células T) em pacientes com leishmaniose, bem como a concentração de populações específicas no compartimento pleural de pacientes com pleurite tuberculosa. Esta análise é aliada à avaliação de parâmetros como a modulação da expressão de moléculas de superfície indicadoras de ativação e memória (CD7, CD28, CD30, CD45RA/RO, CD57, HLA-DR).

A ocorrência de ativação em macrófagos de doadores em cultura, infectados ou não com cepas de Leishmania, em resposta a estímulos como TGF-, IFN-, Zn, LPG e LPS, também tem sido por nós avaliada através da citometria de fluxo. Utilizando a marcação de superfície para moléculas de adesão, moléculas co-estimulatórias e outras moduláveis por ativação (CD11a, CD11b, CD14, CD16, CD49d, CD49e, CD54, CD64, CD86, HLA-DR e HLA-ABC), pretendemos avaliar a resposta de macrófagos na fase inicial da infecção por leishmania.

Finalmente, nós também avaliamos a atividade estimulatória de lectinas brasileiras analisando o aumento da expressão de CD25 (IL-2R) na superfície das células do linfonodo poplíteo de camundongos BALB/c. Estas lectinas mostraram-se capazes de estimular in vivo a ativação e a proliferação de células do linfonodo poplíteo 15 h após a injeção subcutânea no coxim da pata, e nossos estudos sugerem que elas constituem potentes ativadoras de linfócitos T.

Avaliação da ocorrência de apoptose. Além das marcações de superfície, temos utilizado a marcação com iodeto de propídio, com anexina V e com 7-aminoactinomicina D (7-AAD) para avaliar a ocorrência de apoptose em células mononucleares de sangue periférico ex vivo e após o cultivo com estímulos específicos, em amostras de pacientes com leishmaniose visceral e tuberculose pulmonar, simultaneamente à fenotipagem (por marcação de moléculas de superfície) das células envolvidas. Com o iodeto de propídio ou a 7-AAD é possível observar em células permeabilizadas a existência de populações hipodiplóides, compatíveis com a ocorrência de apoptose, enquanto que a marcação com anexina V e iodeto de propídio ou 7-AAD permite avaliar a população de células que se encontra no início do processo de apoptose, distinguindo-as das células necróticas. Marcação intracitoplasmática para citocinas. Estamos também principiando a investigação das subpopulações celulares responsáveis pela produção de citocinas no líquido pleural de pacientes com pleurite tuberculosa, utilizando a marcação simultânea de moléculas de superfície e intracelulares. Estamos investigando se a produção de citocinas ocorre associada ao subconjunto de células CD4+ com fenótipo de memória, ou existe participação de células CD8+, TCR e NK.

Interações Celulares Heterotípicas no Timo. Caracterização Fenotípica de Subpopulações Linfocitárias que Aderem in vitro à Células do Microambiente Tímico.

Vinícius Cotta-de-Almeida - Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Ultraestrutura e Biologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ.

O processo de diferenciação intratímica de linfócitos T compreende a chegada de precursores no timo e a saída de linfócitos T imunocompetentes do órgão. Concomitante a um vasto corpo de interações celulares e moleculares existe uma migração intensa e ordenada de timócitos no contexto tecidual da rede tridimensional do microambiente tímico, resultando em importantes alterações genéticas e bioquímicas que caracterizam a diferenciação intratímica de células T, um dos eventos mais interessantes e complexos na fisiologia do sistema imunitário.

A diferenciação intratímica de células T envolve o estabelecimento de interações complexas entre os próprios timócitos em diferentes estágios de maturação e o chamado microambiente tímico. Esses timócitos migram no interior do órgão a partir da região cortical para a região medular dos lóbulos tímicos, simultaneamente a eventos de diferenciação de células DN em células DP, seguidos de seleção positiva e seleção negativa destas, culminando com a maturação em células SP CD4 ou CD8. Isto parece acontecer de forma ordenada, como se os timócitos estivessem em uma “esteira rolante”. Dessa forma, podemos imaginar uma sequência de adesão/migração ocorrendo simultaneamente aos processos de interação timócito/microambiente, desde a entrada de precursores no timo até a saída de células maduras para os órgãos linfóides periféricos.

No presente trabalho decidimos estudar in vitro algumas interações heterotípicas relevantes que ocorrem no timo, investigando a contribuição relativa de diferentes subpopulações celulares na adesão a vários tipos celulares componentes do microambiente tímico. Com esse intuito utilizamos um modelo no qual, após co-cultura de timócitos com células do microambiente tímico, separamos os timócitos em células aderentes e células não-aderentes. Dessa forma, timócitos aderentes e não aderentes foram separadamente analisadas por citometria de fluxo utilizando-se anticorpos monoclonais dirigidos contra marcadores que definem subpopulações e graus de maturação de linfócitos T, como as moléculas CD3, CD4, CD8 e CD24. Além disso a participação de integrinas e moléculas da matriz extracelular modulando este processo de adesão tem sido investigada utilizando-se anticorpos contra estas moléculas e com posterior análise das subpopulações presentes nos grupos aderentes e não-aderentes.

Com esta estratégia demonstramos que timócitos que aderem sobre duas linhagens de células epiteliais tímicas (2BH4 e IT-76M1), são preferencialmente células imaturas de fenótipo CD3-/lo/CD4+/CD8+. Dados preliminares sugerem por outro lado, que células mais imaturas ainda (CD3-/CD4+/CD8+) apareceram em quantidades significativas entre as células que aderem a culturas primárias de células epiteliais tímicas derivadas de complexos linfoepiteliais de células “nurse” do timo. Além disso, células do microambiente tímico, de características dendríticas, denominadas de células fagocíticas do retículo tímico parecem interagir preferencialmente com células mais maduras (timócitos simples-positivos CD4 ou CD8). Ainda, é importante ressaltar que pelo menos a integrina VLA4 parece ser fundamental na interação entre timócitos e TEC.



Esses resultados mostrando que diferentes tipos celulares do microambiente tímico interagem de forma seletiva com diferentes subpopulações timocitárias nos levam a sugerir que essas interações refletem as diferentes origens topográficas das células do microambiente tímico.
Além disso, é importante ressaltar que a metodologia descrita neste estudo pode representar uma estratégia importante não só na dissecção de interações na diferenciação intratímica de células T, mas também em outros eventos de interação heterotípica onde intervêm diferentes subpopulações celulares. Nesse sentido já iniciamos alguns estudos onde avaliamos a interação entre células do sistema nervoso e células linfocitárias, no contexto da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi. Mais ainda estamos delineando estudos onde analisaremos o processo de adesão de linfócitos T normais ou obtidos de animais infectados sobre culturas de miócitos normais ou infectados pelo T. cruzi. Nestes estudos, as avaliações consistirão de medição de grau de adesão, análise das subpopulações linfocitárias com capacidade adesiva, bem como possíveis respostas biológicas advindas do processo de interação linfócitos/miócitos (tais como ativação linfocitária, citotoxicidade e morte celular). Além disso, a análise de mecanismos envolvidos no processo de reconhecimento e interação entre linfócitos e células nervosas e entre linfócitos e cardiomiócitos, consitirá da utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra diferentes moléculas de adesão.

Por fim, cabe ressaltar que nestes estudos, a utilização da citometria de fluxo tem representado uma ferramenta fundamental na busca de respostas para as questões levantadas e ainda com grande implicação nos conceitos que advêm desses resultados.
Mesa Redonda 4 – Funções Celulares

Estudos sobre Imunopatologia da Dengue usando Citometria de Fluxo

Farid Von Sydow, L. A. Elzinandes L.A. Braga, Marta A. Santiago, Álvaro L. Bertho, Claire F. Kubelka - Departamentos de Virologia e Protozoologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCUZ, Rio de Janeiro, RJ.


A partir do início da década dos anos oitenta a dengue se disseminou pelo país e tornou-se endêmica. Nos 6 primeiros meses de 1998, a doença, que era ainda apenas ameaçadora, se passou a ter um cunho alarmante com os 300 mil casos notificados. A manifestação clínica da infecção pode ser assintomática ou uma doença branda, mas freqüentemente desenvolve-se com severidade gradual chegando até o Dengue Hemorrágico (Dengue Hemorragic Fever ou DHF) e/ou Síndrome de Choque da Dengue (Dengue Shock Syndrome ou DSS). (Dias, M., 1988).

Postula-se que a base para a DHF/DSS seja uma resposta imunológica patológica (Halstead, 1990 e Monath, 1986). As reações mediadas por células imununológicas são potencialmente eficazes no reconhecimento de proteínas virais na membrana da célula infectada, cuja lise por células T citotóxicas (CD8+) ou natural (NK) beneficia o hospedeiro. Por outro lado a reação imunológica também pode provocar lesões teciduais mais severas do que a provocada pelo vírus (Riegler et al. 1993) tais como dano hepatocelular (Baba et al. 1992). Citocinas pró-inflamatórias, IL-6, IL-1, TNF- são conhecidamente importantes em choques endotóxicos durante infecções bacterianas e estão envolvidas em sintomas semelhantes aos apresentados durante DHF/DSS tais como o desenvolvimento de hemoconcentração e choque hipovolêmico. Estes fatores têm sido encontrados em pacientes com dengue na Ásia e América Central ((Hober et al. e Kuno & Bailey 1994) e TNF-a foi dectado por nós em pacientes brasileiros (Kubelka 1995, Pinto 1997 e Braga, 1997).

A produção provável de IFN- durante uma infecção secundária sugere uma resposta de linfócitos do tipo TH1 durante a doença. IFN- aumentaria a taxa de infecção de monócitos por Dengue pelo aumento de receptores Fc-g-RI (Kontny 1988) e induziria assim uma população de células mais permissíveis ao vírus. Macrófagos infectados pelos vírus da Dengue opsonizados por anticorpos numa infecção secundária, seriam ativados, liberando vários fatores, entre eles, monocinas e derivados do ácido aracdônico. Estes fatores estariam envolvidos na patologia do DHF/DSS, de acordo com o modelo defendido por Halstead (1990).Todavia, o entendimento da função destes fatores ainda está longe de ser plenamente elucidado.

É imprescindível, portanto, dispor de uma metodologia adequada para que se possa determinar com segurança o padrão de citocinas importantes para vírus candidatos a vacinas, já que a forma grave da Dengue é imunopatólogica. Até o momento não se encontra na literatura descrição sobre o perfil das células imunológicas durante a infecção por dengue.

A inexistência de um modelo animal que reflita as formas graves da Dengue presentes no homem torna o presente estudo envolvendo material biológico humano de importância para o estabelecimento de parâmetros de severidade da doença também não determinados até o momento. Descreveremos aqui estudos preliminares realizados usando várias abordagens em que a citometria de fluxo foi empregada.

Infecção de diferentes tipos celulares com amostras de Dengue-1 e Dengue-2 e perspectivas de se correlacionar com virulência.

As tentativas de se correlacionar a infecção in vitro com a virulência da amostra ainda não foram bem sucedidas. Os padrões de infecção in vitro são muito variáveis, dificultando a quantificação.

Padronizamos uma técnica por citometria de fluxo para detecção quantitativa de vírus Dengue infectando diversos tipos celulares. Usou-se se marcação intracelular com anticorpos polivalentes contra virus, revelados por anticorpos fluorescentes contra imunoglobulinas de camundongos após fixação com 4% paraformaldeído e permeabilização com 0,1% saponina. Foi-se capaz de se observar o padrão de infecção entre células tradicionais de cultivo C6/36 e Vero em diversas concentrações de vírus. Estas células são mais suscetíveis do que monócitos humanos, que por sua vez requerem quantidades de vírus maiores para haver infecção e são infectadas em taxas bem menores. A técnica mostrou-se bem sensível e quantitativa para detecção de vírus intracelulares e comparação da infecção das diferentes células. Estes experimentos introduzem a possibilidade de se detectar a percentagem de células humanas infectadas com vírus em pacientes com dengue, ou outra virose, e se determinar se esta taxa estaria alterada durante uma infeção secundária, quer seja diminuída por uma imunidade prévia ou aumentada por um mecanismo de enhancement imunológico.

As experiências com monócitos periféricos humanos demonstraram que os virus são capazes de infectar estas células in vitro. Em experimentos de cinética de infecção de 3 a 7 dias o pico de infecção foi no quinto dia com taxa mais alta de células infectadas detectadas por citometria de fluxo. Não houve uma diferença significativa entre os dois sorotipos usados.

Esta linha de pesquisa nos fornece ferramentas para comparar diversas amostras de vírus selvagens Dengue-1 e -2 circulantes no Brasil quanto a sua capacidade de infectar macrófagos com o intuito de se estabelecer um teste para avaliar virulência, já que não existe modelo animal. Também está sendo empregada para outros vírus tais como Vírus Sincicial Respiratório (Sandra Bianchini e Marilda Siqueira) com o intuito de se determinar a capacidade de anticorpos de sorotipos heterólogos reagirem com vírus em células infectadas. A técnica quantifica a reação e auxilia na determinação de semelhanças e diferenças dos vírus principalmente se utilizar anticorpos monoclonais.

Determinação do mecanismo apoptótico de infecção de monócitos. Apoptose é um mecanismo de morte celular programada conhecido para ação de outros vírus nas células alvo de infecção. Determinamos pela primeira vez que monócitos periféricos humanos sofrem apoptose, desencadeada pelo vírus da Dengue , tanto tipo 1 quanto tipo 2. É um processo diferente de morte por necrose celular e expõe fosfotidilserina, um fosfolipídeo ausente em células intactas, capaz de se ligar à Anexin V marcada com fluoresceína e por conseguinte, detectado por citometria de fluxo. Monócitos infectados foram avaliados pela sua capacidade de ligar Anexin V e iodeto de propídio ao seu DNA, o que só acontece nas células necróticas, diferenciando os dois mecanismos. O processo apoptótico provocado pelo vírus da Dengue é máximo também no quinto dia. e ainda não havia sido mostrado em culturas alvos celulares com macrófagos/monócitos, que são os in vivo.

Imunofenotipagem de linfócitos e produção de citocinas em pacientes com Dengue Durante a epidemia de 1998 foram observados clinicamente pacientes em Pinheiral e Niterói, RJ sendo que está sendo realizado um estudo em 30 indivíduos com imunofenotipagem de células, e frequência de células produtoras de citocinas.

A taxa de linfócitos T (tanto CD4 quanto CD8) se encontra deprimida durante a infecção e é recuperada durante a convalescência. Células NK se apresentaram na taxa normal ou ligeiramente aumentadas.

Também foi possível detectar-se IFN- por citometria de fluxo usando a marcação intracelular semelhante à detecção de vírus em linfócitos mononucleares periféricos dos pacientes após uma resposta específica para o vírus; adicionalmente as células foram cultivadas com monencina durante as últimas 5 horas para inibir a liberação de proteínas (citocinas) excretadas. É provável que células NK produzam IFN- e induzam uma resposta TH1, com ativação de macrófagos e produção de citocinas pró-inflamatórias.

Perpectivas: Em relação a estudos realizados ex vivo tanto com freqüência de células infectadas com vírus ou de células produtoras de citocinas o próximo passo deverá ser a detecção não por reações de imunofluorescência mas sim por hibridização in situ com sondas marcadas com digoxigenina e anticorpos antidigoxigenina marcados com fluoresceína e/ou rodamina. Esta metodologia parece totalmente adequada principalmente para citocinas que são liberadas extracelularmente enquanto o RNA mensageiro permanece intracelular. Ainda é possivel amplificar o sinal da célula por reações de RT-PCR com produção de cDNA homólogo antes da hibridização. Estas técnicas embora um pouco mais complicadas são mais sensíveis e apresentam uma alternativa para as reações de ELISPOT na determinação de freqüências de células produtoras quer de virus ou de citocinas, podendo responder diferentes perguntas com abordagens semelhantes.

Colaborações: Colaboraram nos aspectos clínico-laboratoriais do dengue durante o trabalho a médica Sonia Zagne e a pesquisadora Rita Nogueira e na marcação de citometria de fluxo Adriana Gouvea e Patrícia Neves.

Referências Bibliográficas

*Baba M, Fukay K, Hasegawa H. 1992. J. Clin. Immunol. 38:.1-14.

*Braga, E.L.A.1, Cordeiro, M.T.2, Pinto, L.M.O1, Kubelka, C.F XXII Reunião Anual da SBI 28.9-1.10.97.Angra dos Reis. Differential production of TNF-, IL-6 and IL-1 in serum of the Dengue Fever and Dengue Hemorrhagic Fever/Dengue Shock Syndrome patients.(Submetido p/ publicação)

*Dias, M., 1988.in: Manual de Dengue. Departamento Geral de Epidemiologia. Secretaria Estadual de Saúde do Rio de Janeiro

Dinarello CA.. 1996 Bood; 87: 2095-147.

*Halstead, S. B., 1990. Curr. Opinion Infect. Dis., 3: 434-438 ;

*Hober et al. 1993 Am J Trop Med Hyg 48: 324 and G Kuno, RE Bailey 1994 Mem Inst Oswaldo Cruz 89: 179

*Kontny et al., 1988. J. Virol., 62: 3928-33 ;

*Kubelka CF Borges PA, VonSydow FFO, Lampe E. 1995. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 90: 741-742,

*Pinto, LMO; SA Oliveira; ELA Braga; RM Nogueira; & CF Kubelka 4th International Symposium on Dengue fever Tahiti, 14-17 04.97. TNF-, IL-6, IL-1, sTNF RI, sTNF RII and IL-1 Ra Profiles in Dengue Infected Brazilian Patients

*Pinto, Luzia M. O.; Solange. A. Oliveira; Elzinandes. L. A. Braga; Rita. M. Nogueira; & Claire F. Kubelka Increased Proinflammatory Cytokines (TNF- and IL-6) and Antiinflammatory Compounds (sTNFRp55 and sTNFRp75) in Brazilian Patients during Exanthematic Dengue Fever.. (submetido p/ J. Med. Virol.)

*Monath, T. P., 1986. in: The Togaviridae and Flaviviridae. (Eds) S. Schlesinger e M. J. Schlesinger, 375-440 ;



Caracterização do receptor purinérgico P2Z em células dendríticas de baço através da citometria de fluxo.

Nihei1 , O.N., Campos-de-Carvalho2, A.C. , Savino1 , W. e Alves1, L.A., - 1-Lab. de Pesquisas sobre o Timo, Depo. de Imunologia, Fiocruz, RJ, 2- Lab. de Membranas Excitáveis- IBCCF-UFRJ


No sistema imunitário, a adenosina 5’-trifosfato extracelular medeia uma variedade de efeitos, principalmente por meio da ativação de um subtipo particular de receptor, o purinoceptor P2Z/P2X7, formador de poro. Neste estudo, caracterizamos o purinoceptor P2Z/P2X7 e a modulação da atividade endocitária mediada por ATP em células dendríticas esplênicas (DCs). Tanto a permeabilização como a endocitose foram analisadas por microscopia óptica e citometria de fluxo. A permeabilização das DCs induzidas por ATP foi avaliada utilizando-se traçadores de baixo peso molecular tais como brometo de etídio (Mr 314 Da), lucifer yellow (Mr 457 Da) e YO-PRO-1 (Mr 683 Da). Tal efeito foi dose-dependente (EC50 em salina padrão: 0.72 mM), mediado pelo forma aniônica do agonista (ATP-4), e estimulado especificamente pelo ATP, BzATP e SATP. A atividade endocitária foi avaliada com fluoresceína isotiocianato-dextran de alto peso molecular (Mr 10.000 Da), a qual não atravessa o poro do purinoceptor P2Z/P2X7. O típico aumento do cálcio intracelular relacionado a ativação do receptor P2Z/P2X7 foi detectado por microfluorimetria usando FURA2-AM. Por microscopia confocal, também verificamos um aumento na endocitose em DC mediado pelo ATP extracelular. Tanto a endocitose como a permeabilização induzidas pelo ATP extracelular foram completamente bloqueadas com o tratamento das DCs com 300 M de ATP oxidado, um antagonista específico do receptor P2Z/P2X7. Nossos dados mostram que DCs são sensíveis ao ATP extracelular, que modula pelo menos uma função das DC, a macropinocitose, a qual está relacionada à apresentação de antígenos.

Financiamento: CNPq, FAPERJ, PRONEX e FUJB- UFRJ



Modulação da Distribuição e Expressão Fenotípica dos Linfócitos B1 na Esquistossomose Murina Experimental.

Márcia Cury EI Cheikh - Laboratório de proliferação e diferenciação celular - Departamento de Histologla e Embriologla – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ.


Os linfócitos B1 são definidos como uma subpopulação de linfócitos B, que expressam a maioria dos mercadores encontrados nos linfócitos B convencionais ou B2 em associação com a molécula CD5, um marcador pan-T. Fenotipicamente são caracterizados como sendo células que expressam IgMhi ,IgD10 e Mac-l+ na cavidade peritoneal e Mac- I - no baço.

Em camundongos, durante a vida fetal, são preferencialmente encontrados no momento e no ligado, e, em neonatos, no baço e subsequentemente na cavidade peritoneal. Em camundongos adultos são encontrados preferencialmente nas cavidades peritoneais, pleurais e na lâmina própria do intestino. São mantidas por uma extensa capacidade de auto-renovação, ao contrário dos linfócitos B, cuja produção é obtida a partir de precursores da medula óssea.

Os linfócitos B1 secretam principalmente auto-anticorpos que são do tipo IgM, IgG3 e IgA (em mucosa), que são de largo espectro e baixa afinidade. Estas células encontram-se aumentadas nas doenças autoimunes.

A esquistossomose murina experimental cursa com a formação de granulomas induzidos pelos ovos embolizados no sistema mesentérico intrahepático. Os vermes adultos com seus produtos de secreção e excreção, bem como seus ovos, são localizados principalmente na cavidade abdominal, onde induzem intensa reação inflamatória crônica, que envolve vísceras e cavidade peritoneal.

Em função da hipereatividade celular envolvendo a cavidade abdominal e considerando que esta é o sítio de produção dos linfócitos B1, investigamos se a produção abdominal, circulação e modulação do fenótipo estariam modificados durante a evolução da doença, de sua fase aguda para fase crônica.

A caracterização dos linfócitos B1 quanto aos seus mercadores fenotípicos, foi determinada usando a citometria de fluxo com duplas ou triplas marcações.

Nós observamos que a reação dos linfócitos B1 segue a rota de infecção do parasita. Nenhuma modificação foi observada na fase prepostural. Na fase aguda da doença, observamos que as células CD5hi IgM10, eram negativas para a expressão de Mac-l no baço, seguida de seu aparecimento na placa de Peyer e nos gânglios mesentéricos, onde gradativamente expressavam Mac-l. Pela análise das células usando o critério de tamanho e granulosidade, observamos que as células pequenas do baço seguem a via de migração citada anteriormente.

Na cavidade peritoneal não encontramos aumento das células B1 expressando o fenótipo CD510 IgMhi, nem a mobllização de células com este fenótipo para os tecidos envolvidos com a infecção, mesmo a despeito da intensa resposta inflamatória envolvendo a cavidade.

Com estes dados de fenotipagem associados à análise de tamanho e função secretória, demonstramos que na esquistossomose murina experimental, as células B1 da cavidade abdominal se encontram ativadas, isto é, com a expressão de CD5 diminuída, expressão de lgM aumentada e que a população de células grandes são predominantes. E, que as células presentes nos tecidos como baço, placas de Peyer e gânglios mesentéricos representam um fenótipo distinto dentro do "pool" de linfócitos B1.

Mesa Redonda 5 – Citometria de Fluxo no Estudo do Câncer

Citometria de Fluxo no Estudo do Câncer

Igor Couto da Cruz – Setor de Imunopatologia, Laboratório Dr. Sérgio Franco, Rio de Janeiro, RJ.


A citometria de fluxo é atualmente o principal método para classificação de células hematopoiéticas. A primeira geração de citômetros aplicados a laboratórios clínicos vem do início dos anos 80 e desta época até os nossos dias eles passaram por grandes modificações, com possibilidade de análise de múltiplos parâmetros das propriedades químicas e físicas da célula e das populações celulares homogêneas.

Nesta época, pouquíssimos laboratórios tinham o aparelho no Brasil e quase a totalidade fazia apenas fenotipagem para linfócitos T, B e subpopulação CD4+ e CD8+. Iniciamos o trabalho com as neoplasias hematológicas em 1992. Neste período, poucas instituições executavam este tipo de exame e a especialização com objetivo diagnóstico estava se iniciando em nossos grandes centros. O processo técnico era complicado, com inúmeras etapas e havia perda de material e de qualidade da amostra, porque se fazia necessária a separação dos mononucleares. Como se tratava de material para a fenotipagem de imunodeficiência e neoplasia hematólógica, esta perda importante de células constituía um problema na interpretação dos valores obtidos. A evolução para o método de lise, que permite análise da população celular integral, constituiu a solução.

Seguiu-se a utilização de anticorpos monoclonais, onde cada clone e tipo de fluorocromo pode apresentar uma resposta específica, levando os citometristas a correlacionar estes dados com o de outros tipos de anticorpos para a mesma linhagem e com os dados clínicos. Isto permitiu o aprendizado para selecionar os melhores monoclonais. O avanço obtido nas combinações de dois, três ou mais anticorpos, para revelar as coexpressões, possibilitou rastrear com mais especificidade a população neoplásica e obter melhor definição diagnóstica e prognóstica. Após se definir quais clones a utilizar no painel, foi possível padronizar a intensidade da expressão e associá-la a cada tipo de doença hematológica.

Nos citômetros atuais foram integrados recursos gráficos que são acrescidos de modernização constante, acompanhando a evolução da informática.

Aplicações da Citometria de Fluxo ao Transplante de Medula Óssea.

Júlio C. Voltarelli, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP.


O transplante de células progenitoras hematopoiéticas (CTH) e, particularmente, o transplante de medula óssea (TMO), constitui, com certeza, a mais eficiente modalidade terapêutica para um grande número de neoplasias, tanto linfohematopoiéticas como de órgãos sólidos. Nos últimos anos, progressos consideráveis na tecnologia destes transplantes têm expandido suas indicações e reduzido suas complicações, tornando-os, muitas vezes, a terapêutica de primeira escolha e de significativo sucesso para doenças até então consideradas incuráveis. Por estas razões, unidades de TMO têm sido implantadas em praticamente todos os centros avançados de tratamento de câncer do mundo, inclusive em nosso país.

Neste relato, resumiremos a contribuição da citometria de fluxo para o desenvolvimento dos transplantes de CTH, destacando algumas áreas de experiência pessoal.

Em 1984, no início da era de aplicações clínicas da citometria de fluxo, o grupo de Seattle, pioneiro na implementação do TMO no Homem, publicou uma pequena revisão sobre a utilidade da citometria de fluxo no transplante de medula óssea (1). Este trabalho trata exclusivamente de ensaios de quantificação de células T na medula óssea submetida a processos de depleção destas células para a prevenção da reação de enxerto-contra-hospedeiro (GVHD). Sua conclusão é de que “we have found flow microfluorometry to be an indispensable tool in the development of methods of removing T cells from donor marrow”. Mas acrescentava, profeticamente: “This application of flow microfluorometry technology to human marrow transplantation represents only one of several possible such applications. Flow microfluorometric technology will find utility in any situation requiring sensitive and specific methods for identification of distinct cell populations in human bone marrow or blood”.

Tivemos a oportunidade, entre 1987 e 1988, de participar, no grupo de Seattle, de estudos imunofenotípicos e funcionais visando à compreensão dos mecanismos imunológicos envolvidos na rejeição do transplante de medula óssea, especialmente em seguida à depleção de células T com anticorpos monoclonais (2,3). Antes disto, em colaboração com o Prof. Stites, na Universidade da Califórnia em San Francisco, revimos diversas aplicações, a maioria delas potenciais naquela época, da citometria de fluxo na monitorização laboratorial do paciente submetido ao TMO, que iam da reconstituição imunológica ao diagnóstico de infecções virais, GVHD e doença residual mínima (4).

Uma revisão atual da literatura médica internacional no Medline cruzando os unitermos bone marrow transplantation e flow cytometry revela a existência, no período entre Outubro de 1981 e julho de 1998, de 484 artigos. A maioria deles versa sobre os mesmos problemas levantados acima, detectando-se, entretanto, significativos avanços não só no entendimento fisiopatológico, como também no diagnóstico clínico de algumas destas complicações, como a citomegalovirose e a recaída das leucemias agudas. Outras áreas de grande progresso, que contaram com o apoio decisivo da citometria de fluxo, foram as investigações sobre quimerismo/enxertamento, efeito enxerto-contra-leucemia, aloimunização contra células sanguíneas e, mais recentemente, xenotransplantação e terapia gênica. A identificação de marcadores das células progenitoras hematopoéticas representou também um grande progresso, particularmente para os transplantes autólogos, permitindo, inclusive, a monitorização e otimização da coleta das CTH para transplante.

Em Janeiro de 1991, começou a operar um citômetro FACScan no Laboratório de Hematologia do Hospital das Clínicas da FMRP, provavelmente um dos primeiros no país dedicado à investigação e diagnóstico clínicos. O trabalho do Dr. R. Passetto Falcão e de vários colaboradores neste laboratório amealhou importantes contribuições nos campos de diagnóstico e a imunopatologia das neoplasias linfohematopoéticas (5-8). Posteriormente, instalou-se um equipamento FACSort no Laboratório de Imunologia Celular do Prof. J. Santana da Silva, dedicado a investigações experimentais e outro no Hemocentro Regional de Ribeirão Preto, sob nossa supervisão. Com este equipamento, temos estudado aloimunização antiplaquetária e antineutrofílica pós-TMO, mecanismos imunológicos antileucemia pré e pós-TMO (9) e monitorizado a coleta de CTH de sangue periférico e de cordão umbilical, destinada a transplante. Com a instalação iminente de um citômetro FACSVantage, poderemos ampliar e aprofundar significativamente estes estudos.



Referências Bibliográficas

  1. Martin PJ, Hansen JA & Thomas ED. Use of flow microfluorometry in bone marrow transplantation. Ann N Y Acad Sci 428: 14-25, 1984.

  2. Voltarelli JC, Przepiorka D, Sandell LM, Johnson GA, Kopecky K, Martin PJ< Torok-Storb B. CD8+/DR+/CD25- T lymphocytes associated with marrow graft failure. Bone Marrow Transpl 4: 647-52, 1989.

  3. Voltarelli JC, Corpuz C, Martin PJ. In vitro comparison of two methods of T cell depletion associated with different rates of graft failure after allogeneic marrow transplantation. Bone Marrow Transpl 6: 419-23, 1990.

  4. Voltarelli JC & Stites DP. Immunologic monitoring of bone marrow transplantation. Diagnostic Immunology 4: 171-93, 1986.

  5. Rego EM, Garcia AB, Viana SR & Falcão RP. Characterization of acute lymphoblastic leukemia subtypes in Brazilian patients. Leukemia Res 20: 349-355, 1996.

  6. Falcão Rp, Voltarelli JC, Pestana DR, Simões BP, Zago MA, Figueiredo MS. A T gamma/delta lymphoproliferative disease with NK activity. Am J Hematol 41: 128-31, 1992.

  7. Rego, EM, Tone LG, Garcia AB, Falcão RP. CD10 and CD19 fluorescence intensity of B cell precursors in normal and leukemic bone marrow. Clinical characterization of CD10+strong and CD10+ weak common acute lymphoblastic leukemia. Submitted.

  8. Pestana DR, Falcão RP, Voltarelli JC. Induction of LAK activity in splenic lymphocytes from cancer patients. In press, 1998.

  9. Castro FA, Paula-Santos CM, Voltarelli JC. Stimulation of HLA-DR expression in acute and chronic leukemias. Submitted.

O Papel da Citometria de Fluxo no Diagnóstico dos Linfomas Não Hodgkin e Comparação com o Método Imunohistoquímico

Maria Cláudia Zerbini - Laboratório Fleury, São Paulo, SP.


Os linfomas não Hodgkin (LNH) são proliferações clonais expansivas e destrutivas das células do sistema imune, apresentando-se primariamente nos linfonodos, baço, medula óssea, tecido linfóide associado a mucosa e, menos freqüentemente, na pele ou vísceras sólidas. Em alguns tipo de linfoma, as células linfomatosas podem, em determinado momento da doença, ser detectadas no sangue periférico.

O método básico utilizado no diagnóstico e classificação dos linfomas é ainda o exame microscópico. Entretanto, nos dias de hoje se torna fundamental a complementação do diagnóstico através de sua caracterização imunofenotípica, e, quando possível, citogenética e biologia molecular.

A classificação dos LNH tem sido objeto de muita polêmica na literatura, em função das diferentes filosofias que determinados grupos adotam como seu princípio básico. A classificação que prevalece nos dias de hoje é a assim chamada classificação R.E.A.L., apresentada no Quadro 1, a seguir.

A classificação R.E.A.L. admite como premissa que a célula de origem (B, T ou NK) é fator determinante na subdivisão dos LNH. A premissa da classificação R.E.A.L é a de que deveriam ser identificadas as entidades já reconhecidas e caracterizadas até o momento, utilizando-se a abordagem diagnóstica multidisciplinar. Assim, cada doença seria identificada por uma combinação de características clínicas, morfológicas e imunofenotípicas. Um grupo internacional de pesquisadores de reconhecido conhecimento na área dos linfomas, sob patrocínio da OMS, deve publicar em breve pequenas modificações da classificação REAL, com base em cuidadosa avaliação da mesma. Quadro 1. Classificação Euro-Americana dos Linfomas (REAL, 1994)

Neoplasias de células B


  1. Neoplasias de células B precursoras:

Leucemia/Linfoma de células linfoblásticas B precursoras

  1. Neoplasias de células B periféricas:

  1. Leucemia linfocítica/prolinfocítica de células B/ linfoma de pequenas células B

  2. Linfoma/imunocitoma linfoplasmocitóide

  3. Linfoma de células do manto

  4. Linfoma do centro folicular / folicular

Gráus citológicos provisórios: pequenas células, (gráu 1) mixto de grandes e pequenas células (gráu 2) e de grandes células (gráu 3).

Subtipo provisório: difuso, predominatemente de pequenas células



  1. Linfoma de células B da zona marginal

Extranodal (células B monocitóides do tipo MALT)

Categoria provisória : nodal ( células B monocitóides)

Categoria provisória : esplênico ( linfócitos vilosos)


  1. Leucemia “hairy cell”

  2. Plasmocitoma/ mieloma

  3. Linfoma difuso de grandes células B

Subtipo: Linfoma de células B primário do mediastino (tímico)

  1. Linfoma de Burkiit

10. Categoria provisória: Linfoma de células b de alto gráu, Burkitt’s-like

Neoplasias de células T e prováveis células Natural Killer

I. Neoplasias de células T precursoras:

Linfoma / leucemia linfoblástica de células T precursoras




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