VariaçÕes do número de cópias na síndrome de câncer colorretal hereditário e agregaçÃo familial



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VARIAÇÕES DO NÚMERO DE CÓPIAS na SÍNDROME DE CÂNCER colorretal HEREDITÁRIO E AGREGAÇÃO FAMILIAL.
COPY NUMBER VARIANTS IN SYNDROME OF COLORECTAL CANCER AND FAMILIAL AgGREGATION
Aluno-autor: Eliane Roio Ferreira; Orientador: Rogério Saad Hossne; Colaboradores: Silvia Regina Rogatto, Erika Maria Monteiro Santos.

Campus de Botucatu – Faculdade de medicina de Botucatu – Medicina – eliane_roio@yahoo.com.br – PIBIC/CNPQ.



Resumo
Palavras-chave: câncer colorretal hereditário; agregação familial; variação do número de cópias.

Keywords: Hereditary colorectal cancer; familial aggregation; copy number variants.




INTRODUÇÃO

As variações estruturais no número de cópias são uma nova forma de variação genética, identificada nos últimos anos. (Sebat et al., 2004; Feuk et al., 2006). A sua importância decorre do fato de poderem influenciar a suscetibilidade a doenças complexas como o câncer. (McCarroll e Alshuler, 2007; Beckmann et al., 2007).Apesar disso, a investigação de CNVs é uma abordagem quase inexplorada para a descoberta de novos genes no câncer familial. (Shlien et al., 2008).

Esses estudos podem ajudar a estabelecer um perfil das doenças, como no caso da Síndrome de Lynch(LS). Esta doença é caracterizada pelo processo acelerado de carcinogênese, por mutação em genes de reparo do DNA, com idade precoce de manifestação de tumores colorretais(CRC)(Lynch e Lynch, 2005; Lynch et al., 1988; Marra et al., 1997). Além disso, pode estar associada a tumores extra-colônicos. E acredita-se que os pólipos não tratados nos portadores de mutação tem risco elevado de transformação maligna.

Com relação aos pacientes de alto risco hereditário para CRC, não temos conhecimento de estudos nacionais para avaliar como surgem as lesões precursoras e se ocorrem alterações moleculares associadas. A investigação molecular pode definir o diagnóstico de uma síndrome hereditária. Neste contexto, o julgamento correto do espectro de tumores em LS adquire grande importância; e pode levar a mudanças nos critérios usados para diagnósticos.



OBJETIVOS
Normatizar o diagnóstico clínico e anatomopatológico.

Rastrear com efetividade lesões precoces em cólon.

Estabelecer o diagnóstico molecular dos principais genes envolvidos na etiologia do câncer colorretal e câncer de mama hereditários.

Disponibilizar o modelo de registro em Oncogenético (OncoTree) para as diferentes Instituições envolvidas no projeto.



MATERIAL E MÉTODOS
Serão selecionadas 30 famílias (prospectiva e retrospectivamente) que apresentem os critérios clínicos internacionalmente aceitos para a categorização de uma Síndrome de Câncer Familial ou agrupamentos familiais. Tais pacientes serão oriundos do ambulatório de coloproctologia (câncer) da disciplina de gastrocirurgia da FMB-UNESP. Será aplicado um questionário e colhido amostra de sangue periférico.

Os perfis de variação no número de cópias (CNV) serão analisados usando a versão customizada de microarrays de oligonucleotídeos de 60 mers de 244AK da Agilent(Agilent Technologies, Santa Clara, CA). O desenho da plataforma será realizado com o uso do software eARRAY v4.5 da Agilent (http://earray.chem.agilent.com/earray/login.do) disponível on line. O DNA teste será extraído de linfócitos de sangue periférico dos probandos e seus familiares de acordo com os protocolos padrão. Como DNA referência, será usada uma amostra de DNA comercial (Promega, Mannheim, Germany) de placenta do mesmo sexo que o DNA teste, consistindo de uma mistura de 10 indivíduos normais. Às amostras, serão incorporadas Cy3-e Cy5-dCTPs (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) utilizando reação de marcação por random primer (Bioprime Labeling Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA). Purificação, hibridação e lavagem serão realizadas. As imagens dos arrays serão obtidas com o uso de um scanner a laser da Agilent, e então processadas com o programa Feature Extraction v 9.5.1 e analisadas usando o programa CGH Analytics 3.4.40. O algorítimo estatístico ADM-2 e o limiar de sensitividade 6.0 serão utilizados para determinar as alterações. CNVs comuns serão filtrados por comparações tanto com o banco de dados de 300 famílias brasileiras estudadas em nosso laboratório quanto pelo uso do Database of Genomic Variants (DGV-http://projects.tcag.ca/variation/). Cada região de CNV será avaliada para evidências de ruído ou artefatos experimentais. Os genes candidatos serão avaliados por PCR quantitativa ou seqüenciamento de alta performance (Roche 454).


RESULTADOS E DISCUSSÃO
O trabalho está em andamento. Até a presente data foram selecionados 140 pacientes do ambulatório de Gastrociurugia do HC da Unesp. Destes, 17 foram excluídos por se tratarem de casos de PAF (Polipose Adenomatosa Familiar); 27 por não haver laudos anatomo-patológicos para comprovação do câncer colorretal no sistema local de dados; 29 por não poderem ser incluídos nos critérios utilizados neste estudo; 6 por terem falecido antes da data em que seriam convidados; 1 por decisão pessoal em não querer participar ; 4 por não terem comparecido na data marcada para a primeira entrevista; 15 que não foram encontrados; e 11 pediram para serem convocados posteriormente.

Os probandos convocados, incluídos nos critérios Amsterdam ou Bethesda,13 no total, foram entrevistados, assinaram o TCLE, e foi colhido amostra de sangue, que foi enviada ao laboratório Neogene da Faculdade de Medicina de Botucatu. Isso também foi feito com 27 familiares desses probandos, fossem eles afetados ou não, totalizando 40 pessoas no estudo. Para cada família foi construído um heredograma e os protocolos foram preenchidos.

Todos os afetados também assinaram um termo de responsabilidade para que os blocos dos seus tumores pudessem ser retirados, na Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, para subseqüente análise deste estudo. Tal termo também foi assinado pelos familiares responsáveis das pessoas já falecidas. Até o momento temos 15 blocos de tumores.

Para os familiares falecidos dos probandos foram pedidos os prontuários para que tivéssemos acesso aos laudos de biópsias para comprovação do câncer, para preenchimento dos protocolos e para fazermos os pedidos dos blocos dos tumores.

Dentre as 13 famílias encontramos em média 5,7 afetados com câncer por família, sendo mais da metade casos de câncer colorretal(CCR). Entre vivos e falecidos houve 39 casos de CCR, com idade média de aparecimento aos 43 anos. O número máximo que houve de afetados em uma única família foi de 9 casos de CCR. A idade mínima encontrada entre os afetados entrevistados para o aparecimento do CCR foi de 26 anos.

Em relação à outros cânceres encontramos 8 casos de câncer de estômago, 4 de câncer de endométrio, 2 de câncer de mama, 3 de câncer de útero, 3 de câncer de garganta, 2 de câncer de fígado, entre outros.

A detecção da mutação permitirá identificar os indivíduos que apresentam um risco em desenvolver carcinoma e os familiares portadores, mesmo que assintomáticos.

A identificação de indivíduos em risco para o câncer hereditário é de grande importância, pois vai permitir que indivíduos afetados tomem conhecimento de que apresentam um risco aumentado em relação a população e de que existem protocolos de rastreamento ou guias de conduta a serem seguidos para a redução deste risco. Medidas de rastreamento intensivo e intervenções preventivas (cirurgias profiláticas e quimioprofilaxia) se mostram eficazes em reduzir significativamente o risco de câncer em portadores de mutação. (Rebbeck, 1999; Hartmann et al., 1999; Eisen, 2000; Hartmann et al., 2001; Meijers-Heijboer et al., 2001; Shih et al., 2002; Kauff et al., 2002; Rebbeck, 2002; Eisen et al., 2005).

A identificação da mutação em um indivíduo não afetado vai permitir a diminuição da ansiedade do indivíduo e de sua família, assim como a redução dos custos com rastreamento e intervenções preventivas desnecessárias. (Grusenmeyer et al., 2007; Meropol et al., 2007).

Os pacientes com a síndrome de Lynch devem ser acompanhados periodicamente, assim como seus familiares que apresentam risco em desenvolver o câncer. O acompanhamento deve incluir colonoscopia com um a dois anos de intervalo, com início entre 20-25 anos; exame ginecológico com ultrassonografia transvaginal e biópsia aspirativa anual, com início entre 30-35 anos; endoscopia digestiva alta, especialmente se há câncer gástrico na família, com um a dois anos de intervalo, com início entre 30-35 anos; ultrassom abdominal; urianálise e citologia urinária, com um a dois anos de intervalo, com início entre 30-35 anos.



A realização periódica dos exames indicados possibilita que tumores sejam detectados em estágio inicial, evitando procedimentos de alto custo necessários no tratamento de tumores avançados, como cirurgias de grande porte e longas internações, assim como, tratamentos quimioterápicos. Desta forma, pacientes e familiares que apresentam alto risco para o desenvolvimento de tumores, muitas vezes assintomáticos, podem receber um acompanhamento individualizado visando à detecção precoce de tumores.

CONCLUSÕES
Ainda não há resultados das análises genéticas para o levantamento de conclusões segundo alguns dos objetivos propostos inicialmente.

REFERÊNCIAS

  1. Feuk, L et al. Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet, 7, 85-97, 2006.

  2. McCarroll, SA and Altshuler, DM. Copy-number variation and association studies of human disease. Nat Genet, 39, 37-42, 2007.

  3. Beckmann, JS et al. Copy number variants and genetic traits: closer to the resolution of phenotypic to genotypic variability. Nat Rev Genet, 8, 639-646, 2007.

  4. Shlien, A et al. Excessive genomic DNA copy number variation in the Li-Fraumeni cancer predisposition syndrome. Proc Natl Acad Sci USA, 105, 11264-11269, 2008.

  5. Marra, MA et al. High throughput fingerprint analysis of large-insert clones. Genome Res, 7, 107210-84, 1997.

  6. Lynch, HT et al. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer-Lynch syndromes I and II. Gastroenterol Clin North Am, 17, 679-712, 1988.

  7. Lynch, HT and Lynch, PM. Molecular screening for the Lynch syndrome-better than family history? N Engl J Med, 352, 1920-1922, 2005.

  8. Rebbeck, TR. Inherited genetic predisposition in breast cancer. A population-based perspective. Cancer, 86, 2493-2501, 1999.

  9. Hartmann, A et al. Frequent genetic alterations in simple urothelial hyperplasias of the bladder in patients with papillary urothelial carcinoma. Am J Pathol, 154, 721-727, 1999.

  10. Hartmann, W et al. Promoter-specific transcription of the IGF2 gene: a novel rapid, non-radioactive and highly sensitive protocol for mRNA analysis. Virchows Arch, 439, 803-807, 2001.

  11. Eisen, TG. Thalidomide in solid tumors: the London experience. Oncology, 14, 17-20, 2000.

  12. Meijers-Heijboer, H et al. Breast cancer after prophylactic bilateral mastectomy in women with a BRCA1 or BRCA2 mutation. N Engl J Med, 19, 159-164, 2001.

  13. Kauff, ND et al. Incidence of non-founder BRCA1 and BRCA2 mutations in high risk Ashkenazi breast and ovarian cancer families. J Med Genet, 39, 611-614, 2002.

  14. Eisen, A et al. Breast cancer risk following bilateral oophorectomy in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: an international case-control study. J Clin Oncol, 237, 491-496, 2005.

  15. Grusenmeyer, PA et al. Interpreting the economic literature in oncology. J Clin Oncol, 25, 196-202, 2007.

  16. Meropol, NJ et al. Cost of cancer care: issues and implications. J Clin Oncol, 10, 180-186, 2007.

  17. Sebat, J et al. Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science, 305, 525-528, 2004.



APOIO FINANCEIRO: PIBIC/CNPQ

PROTOCOLO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA: 3344-2009
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