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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA


PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : __08_/____2015______ a __02__/___2016____

( x ) PARCIAL

( ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Ultraestrutura e composição mineral do esmalte dental submetido ao tratamento clareador excessivo


Nome do Orientador: Sandro Cordeiro Loretto
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Faculdade de Odontologia
Instituto/Núcleo: ICS
Laboratório: Laboratório de Biomateriais (Programa de Pós-Graduação em Odontologia)
Título do Plano de Trabalho: Ultraestrutura e composição mineral do esmalte dental submetido ao tratamento clareador excessivo
Nome do Bolsista: Mara Eliane Soares Ribeiro
Tipo de Bolsa : ( ) PIBIC/ CNPq

( ) PIBIC/CNPq – AF

( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador

( ) PIBIC/UFPA

( ) PIBIC/UFPA – AF

( ) PIBIC/ INTERIOR

( )PIBIC/PARD

( ) PIBIC/PADRC

( x ) PIBIC/FAPESPA

( ) PIBIC/ PIAD

( ) PIBIC/PIBIT

Atenção : No relatório aborde diretamente os pontos essenciais, a partir dos quais será avaliado o desenvolvimento do projeto.

O relatório não deverá ultrapassar 10 MB ou conter mais de vinte (20) páginas.


INTRODUÇÃO
O clareamento caseiro preconiza a utilização de uma concentração baixa do agente clareador (peróxido de carbamida de 10 à 22% ou peróxido de hidrogênio de 3,5 à 10%) por um período de tempo mais longo, quando comparado com a técnica realizada em consultório (Alqahtani, 2014; Meireles e colaboradores, 2012). A literatura científica, e os próprios fabricantes, asseveram a importância de não exceder o tempo recomendado para uso do gel clareador, a fim de não ultrapassar o chamado ponto final de clareamento dental, onde a ação dos peróxidos não irá limitar-se somente às substâncias cromatogênicas, passando a atuar também sobre a estrutura mineral do dente, implicando em efeitos deletérios a mesma (Carey, 2014).

Buscando alcançar dentes cada vez mais claros, é recorrente que o paciente exceda o tempo determinado pelo cirurgião-dentista para aplicação do gel. A literatura científica, por sua vez, é insuficiente quanto às consequências geradas na superfície, propriedades mecânicas, estrutura, composição e cristalografia do esmalte dental decorrentes do uso por tempo prolongado de géis clareadores na técnica caseira (Perdigão, Baratieri e Arcari, 2004).



Dentre os agentes com função clareadora, há o peróxido de hidrogênio, que mesmo em baixas concentrações, é um ativo químico potencialmente capaz de induzir alterações estruturais no esmalte dental ( Abouassi, Wolkerwitz e Hahn, 2011). Alterações ultraestruturais, dentro do período de tempo determinado pelo fabricante, são observadas na superfície deste substrato pós-clareamento: depressões, porosidade e maior profundidade dos sulcos do esmalte, além de modificações nas propriedades físicas e composição química (Cakir e colaboradores, 2011; Perkersoy, 2014).

Deste modo, frente à limitação de evidências científicas do uso prolongado (clareamento excessivo) do peróxido de hidrogênio a 4% empregado na técnica de clareamento caseiro supervisionado, o objetivo deste estudo foi avaliar as consequências de tal período de exposição ao gel clareador em diferentes níveis de organização estrutural do esmalte, por meio de testes macroscópicos (rugosidade e microdureza), passando por análises sensíveis, microscopia eletrônica de varredura e energia dispersiva de raios-x, até a análise do arranjo molecular, por meio da difração de raios-x.

JUSTIFICATIVA
A técnica do clareamento caseiro permitiu ao paciente a co-participação no tratamento despendido pelo cirurgião-dentista, onde o mesmo passa a ter acesso ao material clareador e a realizar sua administração. A autonomia dada ao paciente pela modalidade de tratamento reflete, reiteradas vezes, o uso indiscriminado e por tempo prolongado dos géis clareadores (peróxido de carbamida ou peróxido de hidrogênio). A literatura científica, por sua vez, traz bem estabelecidos os efeitos do clareamento dental sobre o esmalte quando este é realizado sob o protocolo adequado. Entretanto, a prática clínica aponta frequentemente para uma alteração do protocolo de clareamento dental, onde o mesmo passa a ser prolongado por um período além do que é preconizado pelos fabricantes dos produtos. Frente a tal realidade e pela carência de informações a este respeito, o objetivo deste estudo foi avaliar a rugosidade, microdureza, ultraestrutura, composição química e estrutura cristalográfica do esmalte submetido a um tratamento clareador prolongado.
OBJETIVOS:

Objetivo principal:

Analisar a rugosidade, microdureza, ultraestrutura, composição química e estrutura cristalográfica do esmalte dental após exposições excessivas ao peróxido de hidrogênio a 4% (clareamento excessivo).


Objetivos específicos:

1. Avaliar qualitativamente, por meio da Microscopia Eletrônica de Varredura, os efeitos de exposições excessivas ao peróxido de hidrogênio a 4%, após um aumento de 50% e 100% no tempo de aplicação recomendado ao material;

2. Caracterizar quimicamente o esmalte clareado excessivamente com peróxido de hidrogênio a 4%, após aumento de 50% e 100% no tempo de aplicação recomendado ao gel clareador, por meio da Espectroscopia por Energia Dispersiva de Raio-X;

3. Quantificar a microdureza no esmalte clareado excessivamente, após aumento de 50% e 100% no tempo recomendado de aplicação do peróxido de hidrogênio a 4%;

4. Quantificar a rugosidade no esmalte clareado excessivamente, após aumento de 50% e 100% no tempo recomendado de aplicação do peróxido de hidrogênio a 4%;

5. Caracterizar a estrutura cristalográfica do esmalte clareado excessivamente, após aumento de 50% e 100% no tempo recomendado de aplicação do peróxido de hidrogênio a 4%, através da difração raio-x;


MATERIAIS E MÉTODOS:
Obtenção, caracterização da amostra e aspectos éticos

Esta pesquisa foi aprovada junto ao Comitê de Ética em Pesquisas com Animais de Experimentação da Universidade Federal do Pará (CEPAE – UFPA) (parecer n° 83/2015). Foram utilizados, inicialmente, 80 dentes incisivos bovinos hígidos (com 24 meses de idade) da espécie Bos taurus indicus, obtidos de animais abatidos na Cooperativa da Indústria Agropecuária do Pará (SOCIPE, Belém, PA, Brasil). Foram incluídos na pesquisa dentes que estavam irrompidos na cavidade oral, com coroa hígida e formação completa da raiz.

Após as extrações, os dentes passaram por um processo de desinfecção (timol a 0.1%) por 1 semana, seguido de lavagem em água corrente e remoção de qualquer resquício de sangue ou tecido aderido. Os dentes foram analisados em lupa estereoscópica (80x) para avaliação de sua integridade estrutural e, logo após, foram armazenados em água destilada (4°C), por um prazo máximo de 6 meses, até o momento da realização dos testes, de acordo com as recomendações da ISO TS 11405:2003.
Preparo dos corpos-de-prova

As coroas dentais passaram por duas secções transversais. A primeira secção foi feita a uma distância de 15mm, mensurada com paquímetro digital (DIN 862; Mitutoyo, São Paulo, SP, Brasil), da junção amelo-cementária e paralela à borda incisal. O segundo corte, por sua vez, foi realizado a 5mm da junção amelo-cementária, obtendo-se, desse modo amostras da porção média da coroa dental com uma altura de 8mm. A seguir, foi realizada uma secção longitudinal no sentido mésio-distal, a fim de separar as porções vestibular e lingual da coroa dental. As porções linguais de cada coroa foram desprezadas.

Para a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a espectroscopia por dispersão de energia (EDX), a camada de dentina vestibular foi removida com o auxílio de uma broca diamantada nº 4138 (KG Sorensen, Cotia, São Paulo, SP, Brasil) em alta rotação e sob refrigeração constante, restando apenas o esmalte dental vestibular. Em seguida, todos os fragmentos passaram por lavagem em banheira ultrassônica (TD30 Plus; Bio-Art, São Paulo, SP, Brasil) com água destilada por 20min.

Os fragmentos de esmalte foram embutidos com silicona de condensação (pasta leve) em matrizes circulares de policloreto de vinila (PVC) com 60mm de diâmetro para que recebessem o tratamento proposto para cada grupo.



Divisão dos grupos
A divisão dos grupos encontra-se representado no Quadro 1.

Quadro 1. Descrição dos grupos experimentais para o MEV e EDS quanto à intervenção a ser realizada.





Grupos

Material utilizado

Número de aplicações (dias)

G1 (controle negativo)

Gel hidrossolúvel; Johnson & Johnson, São Paulo, SP, Brasil

28

G2 (tempo de aplicação determinado pelo fabricante - controle positivo)

Whiteness Class 4%; FGM, Joinville, SC, Brasil

14

G3 (tempo determinado pelo fabricante com um acréscimo de metade desse tempo - clareamento excessivo 50%)

Whiteness Class 4%; FGM, Joinville, SC, Brasil

21

G4 (dobro do tempo determinado pelo fabricante - clareamento excessivo 100%)

Whiteness Class 4%; FGM, Joinville, SC, Brasil

28


Clareamento dental

O agente clareador utilizado foi o peróxido de hidrogênio 4% com cálcio (PH4) (Whiteness Class 4%; FGM, Joinville, SC, Brasil), aplicado diariamente por 2h com o auxílio de moldeiras individuais, com uma proporção de 0.1ml de gel clareador para 0.05ml de saliva artificial. O grupo controle negativo foi tratado com um gel a base de água com textura similar à do gel clareador (Johnson & Johnson, São Paulo, SP, Brasil), aplicado juntamente com saliva artificial na mesma proporção do PH4.

Para aplicação do material clareador foram utilizadas moldeiras de acetato com o diâmetro compatível ao da matriz de PVC em que os dentes foram montados, confeccionadas em uma plastificadora a vácuo, a fim de impedir a formação de bolhas decorrentes da interação entre o PH4 e compostos orgânicos presentes no esmalte dental. Durante o período de permanência do gel clareador na superfície de esmalte, os corpos-de-prova foram acondicionados em estufa biológica (37°C).

Decorrido o tempo de aplicação diária do PH4, os espécimes foram lavados com spray de ar/água destilada (1min), a uma distância de aproximadamente 5cm da superfície do esmalte exposto à intervenção. Entre as sessões, os espécimes foram armazenados em saliva artificial (37°C).


Ultraestrutura

Para análise das mudanças ultraestruturais do esmalte após o tratamento proposto para cada grupo (n=20) foi empregada a microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os espécimes foram montados em porta-amostras (stubs) e metalizados para visualização no microscópio eletrônico de varredura (LEO-1430; Carl Zeiss, Oberkochen, BW, Alemanha). Foram obtidas eletromicrografias representativas de cada grupo com uma magnificação de 1500x.


Análise dos resultados

Os resultados obtidos pela quantificação da concentração do peso dos elementos químicos por meio do EDS, após verificação da normalidade (Teste de Shapiro-Wilk), foram avaliados por meio da Análise de Variância (ANOVA one-way), seguido de comparação múltipla (teste Tukey) (p≤0.05).

As eletromicrografias obtidas por MEV foram avaliadas descritivamente por meio da descrição das variações percebidas na micromorfologia do esmalte dental dos diferentes grupos.

As análises estatísticas foram realizadas no software Prism (Graphpad, San Diego, CA, Estados Unidos da América).



RESULTADOS
Ultraestrutura

O esmalte não clareado mostrou-se predominantemente aprismático, com áreas isoladas de perda da sua continuidade. Alterações morfológicas foram notadas a partir do protocolo de clareamento definido pelo fabricante do gel, observando-se áreas com esmalte prismático e aprismático. Todavia, com o progressivo aumento de tempo de exposição ao PH4 (clareamento em excesso), o esmalte prismático se tornou mais frequente, revelando um aspecto compatível com desmineralização, caracterizado pela remoção do centro dos prismas do esmalte. Após 28 dias de tratamento clareador, alterações morfológicas no esmalte prismático foram notadas de maneira mais evidente, com grandes áreas desmineralizadas e perda da porção central dos prismas do esmalte (figura 1).




Figura 1. Eletromicrografias com magnificação de 1500x da superfície do esmalte submetido a diferentes tempos de clareamento com peróxido de hidrogênio a 4% (PH4). A: esmalte não clareado (controle negativo; G1), superfície sem alterações no esmalte aprismático (A.1) e com áreas ocasionais e restritas de exposição do esmalte prismático (seta) (A.2). B: clareamento com PH4 por 14 dias (controle positivo; G2), exposição discreta do esmalte prismático (setas) (B.1 e B.2). C: PH4 por 21 dias (G3), perda da continuidade do esmalte aprismático com exposição de áreas discretas de esmalte prismático (C.1) e esmalte prismático completamente exposto (C.2). D: PH4 por 28 dias (G4), descontinuidade do esmalte aprismático (D.1) e presença de uma superfície notadamente desmineralizada com perda da porção central dos prismas (D.2).


Composição química

Observou-se diferença estatisticamente significante (p≤0.05), após o tratamento clareador, na concentração dos elementos químicos O (oxigênio), Mg (magnésio), P (fósforo), K (potássio), Ti (titânio), V (vanádio), Fe (ferro), Zn (zinco) e Zr (zircônia). Todavia, o protocolo de clareamento com PH4 foi capaz de manter os níveis normais de Ca, além de não interferir nos valores de Cl, não havendo diferença significante para estes elementos (tabela 1).


Tabela 1. Diferença entre a média (e desvio-padrão) da concentração (wt%) dos elementos químicos do esmalte dental submetido a diferentes tempos de clareamento com peróxido de hidrogênio a 4% (PH4) percebida pelo teste ANOVA one-way com pós-teste de Tukey, adotando-se nível α de significância (p≤0.05).




Grupos




G1

G2

G3

G4

O

18.910 (±4.304)a

18.856 (±5.144)a

23.761 (±6.296)b

23.242 (±4.707)b

Mg

0.463 (±0.204)a

0.299 (±0.088)b

0.453 (±0.056)a

0.298 (±0.112)b

P

13.797 (±1.01)a

16.164 (±0.443)b

15.736 (±0.843)b

14.925 (±0.731)c

Cl

0.421 (±0.151)a

0.454 (±0.113)a

0.424 (±0.04)a

0.372 (±0.181)a

K

0.350 (±0.006)a

0.121 (±0.066)b

0.103 (±0.049)b,c

0.069 (±0.034)c

Ca

43.417 (±6.334)a

45.059 (±2.864)a

44.518 (±3.546)a

41.728 (±2.961)a

Ti

0.116 (±0.051)a

0.087 (±0.039)a,b

0.093 (±0.034)a,b

0.076 (±0.0328)b

V

0.191 (±0.002)a

0.095 (±0.033)b,c,d

0.107 (±0.026)c

0.0843 (±0.032)d

Fe

0.151 (±0.1)a,b

0.17 (±0.0491)a,b

0.193 (±0.046)a

0.12 (±0.0401)b

Zn

0.396 (±0.107)a,b

0.37 (±0.111)a,b

0.437 (±0.102)a

0.332 (±0.066)b

Zr

18.998 (±2.938)a,b

17.938 (±1.52)a

20.005 (±2.401)b

18.194 (±1.86)a,b

G1, sem clareamento (controle negativo); G2, aplicação de PH4 por 14 dias (controle positivo); G3, aplicação de PH4 por 21 dias; G4, aplicação de PH4 por 28 dias.

Letras distintas, p≤0.05.


PUBLICAÇÕES:
A presente pesquisa ainda encontra-se em fase de execução, faltando as análises da cristalografia (difração de raio-x), rugosidade e microdureza. Portanto, ainda não há publicações oriundas da mesma.

ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES DE 2016:
- Análises da rugosidade superficial e microdureza (Março/2016);

- Análise cristalográfica (difração de raio-x) (Abril/2016);

- Compilação dos dados (maio/2016);

- Relatório final (junho-julho/2016);

- Submissão à publicação científica (julho/2016).


CONCLUSÃO:
Em conclusão, este estudo mostra com ineditismo, até o momento, que a exposição prolongada do esmalte ao peróxido de hidrogênio a 4% resulta na ação irrestrita do agente clareador à estrutura dental, levando à variação química e exposição do esmalte prismático.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. Alqahtani MQ. Tooth-bleaching procedures and their controversial effects: A literature review. Saudi Dent J. 2014;26(2):33–46.

2. Meireles SS, Fontes ST, Coimbra LAA, Della Bona Á, Demarco FF. Effectiveness of different carbamide peroxide concentrations used for tooth bleaching: an in vitro study. J Appl Oral Sci. 2012;20(2):186–91.

3. Carey CM. Tooth whitening: what we now know. J Evid Based Dent Pract. 2014;14:70–6.

4. Perdigão J, Baratieri LN, Arcari GM. Contemporary trends and techniques in tooth whitening: a review. Pract Proced Aesthet Dent. 2004;16(3):185–92.

5. Abouassi T, Wolkewitz M, Hahn P. Effect of carbamide peroxide and hydrogen peroxide on enamel surface: an in vitro study. Clin Oral Investig. 2011;15(5):673–80.

6. Cakir FY, Korkmaz Y, Firat E, Oztas SS, Gurgan S. Chemical analysis of enamel and dentin following the application of three different at-home bleaching systems. Oper Dent. 2011;36(5):529–36.

7. Peskersoy C, Tetik A, Ozturk VO, Gokay N. Spectrophotometric and computerized evaluation of tooth bleaching employing 10 different home-bleaching procedures: In-vitro study. Eur J Den. 2014;8(4):538–45.

DIFICULDADES:
A cromatografia de íons, inicialmente prevista no plano de trabalho, seria realizada em parceria com o Instituto Evandro Chagas. Entretanto, por questões administrativas, esta análise não foi possível de ser realizada. Sendo assim, no intuito de seguir na busca do máximo de informações científicas acerca das possíveis alterações experimentadas pelo esmalte dental submetido ao tratamento clareador excessivo, foram introduzidas as análises de cristalografia (difração de raio-x), a partir de parceria com o Centro de Geociências da UFPA, rugosidade superficial e microdureza.

Em tempo, informa-se que estas três análises serão realizadas nos próximos meses de março e abril/2016, conforme cronograma constante neste relatório parcial.




PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso.

A bolsista Mara Eliane Soares Ribeiro cumpriu satisfatoriamente todas as atividades previstas no plano de trabalho, tendo participado de todas as etapas experimentais realizadas até o momento. Destaca-se ainda que o plano de trabalho desenvolvido pela bolsista faz parte do projeto de dissertação de mestrado em Odontologia (UFPA) da discente Bárbara Catarina Lima Nogueira.


DATA : _29__/__02___/_16__




_________________________________________

SANDRO CORDEIRO LORETTO

ASSINATURA DO ORIENTADOR



___________________________________________

MARA ELIANE SOARES RIBEIRO

ASSINATURA DO ALUNO

INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição.

FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO :


  1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?



  1. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho ?



  1. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?



  1. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?



  1. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório



  1. Parecer Final:

Aprovado ( )

Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações)

Reprovado ( )


  1. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________

Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.

Data : _____/____/_____.


________________________________________________

Assinatura do(a) Avaliador(a)












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