Relatório técnico científico



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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA


PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, INTERDISCIPLINAR, ACERVO, PIBIT, EBTT E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Agosto / 2016 a Fevereiro / 2017
(x) PARCIAL

( ) FINAL

Título do Projeto de Pesquisa: “Melatonina e Organogênese”

Nome do Orientador: Lucia de Fatima Sobral Sampaio


Titulação do Orientador: Doutorado
Faculdade: Farmácia Instituto/Núcleo: ICB
Laboratório: Bioquímica do Desenvolvimento do Sistema Nervoso
Título do Plano de Trabalho: “Mecanística do efeito da melatonina na embriotoxicidade do benzo[e]pireno nos estágios correspondentes a formação do cálice óptico”
Nome do Bolsista: Reginaldo Almeida Magno Júnior
Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq

( ) PIBIC/CNPq – AF

( ) PIBIC/CNPq- Cota do pesquisador

( ) PIBIC/UFPA

( x ) PIBIC/UFPA – AF

( ) PIBIC/INTERIOR

( ) PIBIC/PRODOUTOR

( ) PIBIC/PRODOUTOR RENOVAÇÃO

( ) PIBIC/FAPESPA

( ) PIBIC/ACERVO

( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR

( ) PIBIC/VOLUNTÁRIO

( ) PIBIC/PIBIT


INTRODUÇÃO:
O Benzo[a]pireno e outros hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) estão presentes no alcatrão da fumaça do cigarro (liberado na combustão), em carnes fortemente grelhadas sobre o carvão e em peixes defumados, assim como na atmosfera, poluindo o ar (Oga, 1996). O benzo[e]pireno é um raro isômero do benzo[a]pireno, com o qual compartilha as mesmas propriedades físico-químicas (Johnson et al., 2007). Ambos os poluentes afetam as populações humanas e selvagens, especialmente os pássaros que aspiram grandes volumes de ar contendo partículas. As partículas poluentes contendo benzo(a)pireno são acumuladas nestas espécies aviárias, biomagnificadas, chegando aos ovos, ainda no oviduto. Interessantemente, a genotoxicidade acontece principalmente nos embriões de galinha expostos após organogênese (Stoncious & Lazutka, 2003).

A melatonina é um hormônio natural produzido principalmente pela glândula pineal durante a noite. Em todos os seres vivos atua como antioxidante, via sítios de ligação, e via receptores de membrana. Seus receptores Mel1a e Mel1b em aves (MT1 e MT2 em mamíferos) estão acoplados a proteína G. Os sítios mais estudados são a calmodulina (proteína ligante de cálcio) e a NRH: quinona reductase (Jockers et al., 2016).

O processo de organogênese do olho envolve múltiplas etapas iniciando com a formação da vesícula óptica e posteriormente pela invaginação do domínio distal dessa vesícula e das lentes sobrepostas resultando na formação do cálice óptico, o qual em seguida será diferenciado em tecidos oculares distintos, completando a formação do olho (Fuhrmann, 2010). Resultados prévios do nosso grupo de pesquisa, mostraram que o benzo(e)pireno produz o aparecimento de embriões com cálices opticos mal formados, dependendo da concentração utilizada, e que o efeito da dose 135 µM/ 10 µl é prevenido por melatonina (17 µM/ 10µl). Nesse trabalho esses efeitos serão investigados.

JUSTIFICATIVA:
Estudos sobre a toxicidade de PHA tem importância tanto para a saúde humana, quanto animal. Durante a organogênese, o benzo(a)pireno aplicado através do saco vitelino de ovos de galinha embrionados (1 dia) leva a redução na eclosão, atraso no desenvolvimento, como baixo peso, e reduzido comprimento do corpo e do bico. Estas alterações foram atribuídas à indução de edema (Oedema syndrome), como ocorre com outros PHA. Além disso, a potência deste PHA foi maior em embriões observados durante a organogênese (Anwer & Mehrotra, 1988). Em outro estudo, ovos de patos embrionados (72 h) tinham a superfície exposta à benzo(a)pireno, resultando em tempo de incubação reduzido, e quando eclodidos exibiram defeitos no olho, cérebro e bico. Além de ossificação incompleta (Hoffman & Gay, 1981).

Estudos do nosso grupo de pesquisa mostram que melatonina faz parte do grupo de sinalizadores do desenvolvimento embrionário (Sampaio et al., 2005; Sampaio, 2008; Sampaio, 2009; Sampaio e Markus, 2010; Silva e Sampaio, 2014; Nogueira e Sampaio, em preparação). Adicionalmente, tanto melatonina quanto o benzo(e)pireno são inibidores da enzima NRH: quinone reductase (Sampaio et al., 2014). Dessa forma, o nosso estudo foi direcionado para o mecanismo de ação usado por melatonina para prevenir a malformação do cálice óptico produzida por benzo[e]pireno em pintainhos.



OBJETIVOS:
Objetivo geral: Investigar a participação de receptores de membrana e sítios de ligação nos mecanismos de ação do neurohormônio melatonina no desenvolvimento de aves.
Objetivo Específico: Investigar o mecanismo de ação, pelo qual melatonina protege dos efeitos embriotóxicos do benzo[e]pireno em embriões de pintainhos.

MATERIAIS E MÉTODOS:

Animais e luz ambiente

Os ovos de embriões de galinha foram colocados na posição vertical (câmera de ar voltada para cima) em uma chocadeira a 37.8 ºC às 18h para incubação em ambiente úmido. A chocadeira possui tampa acrílica transparente que permite o ciclo claro e escuro de 12h em cada ciclo. Os embriões foram utilizados de acordo com o recomendado pelas organizações internacionais de ética em experimentação com animais em estágios embrionários, com aprovação da comissão de ética local (CEPAE-UFPA: 229-14).



Ensaios farmacológicos “In ovo”

Após 48h de incubação (estágio 12), os ovos são retirados da chocadeira e separados nos grupos basal, controle (10 ou 20 µl de água destilada), Benzo(e)pyrene (Sigma) e/ou Melatonin (Sigma). Benzo[e]pireno foi usado com as seguintes concentrações (µM): 0,35; 1,6; 5; 15; 45; 135, 400; 800; 1200. Assim, a quantidade de benzo[e]pireno em cada dose foi, respectivamente: 0,000883 10-9 mole; 0,004036 10-9 mole; 0,012615 10-9 mole; 0,037846 10-9 mole; 0,113539 10-9 mole; 0,340618 10-9 mole; 1,0052 10-9 mole; 2,01848 10-9 mole; e 3,02772 10-9 mole. Melatonina foi usada nas concentrações 0,01; 1 e 100 µM.

Os tratamentos são inoculados na câmara de ar dos ovos embrionados (10 µl/ovo). Após a injeção, os ovos foram colocados novamente na chocadeira. Passadas mais 18 h de incubação, embrião com 56 h, HH18/19 (Hamburger & Hamilton (1992), 1992), os embriões são excisados dos ovos e dissecados inteiros em PBS (4º C; pH 7.4), lavados, e os caracteres morfológicos externos são visualizados em microscópio óptico comum.
Análise dos dados: Foram considerados significantes resultados obtidos de grupos contendo no mínimo 5 embriões. Para o ajuste de curvas foi utilizado o programa Graph Pad Prism.

RESULTADOS:
Nessa etapa do trabalho, foram realizadas curvas concentração-resposta de benzo(e)pireno. A partir desse ponto, os embriões receberam diferentes doses de melatonina. Os resultados obtidos foram conforme o esperado. De acordo com eles, benzo(e)pireno quando administrado nas doses mais baixas (0,35 µM/ 10 µl - 5 µM/ 10 µl) não afetou a formação do cálice óptico, entretanto os embriões apresentaram parcialmente epitélio com coloração acinzentada escura. A partir da dose 15 µM/ 10 µl, os embriões também apresentaram epitélio embrionário com a mesma coloração dos embriões usados nas concentrações molares mais baixas, mas a frequência de embriões com cálice óptico normal, caracterizado por duplo contorno distinto na região da íris, começou a diminuir, chegando a zero quando as doses chegaram a 400 µM/ 10 µl. Nas doses acima de 400 µM/ 10 µl (800 µM/ 10 µl e 1200 µM/ 10 µl), o efeito foi altamente tóxico, não só afetando a formação do cálice optico, como também os embriões apresentaram toxicidade em seus epitélios embrionários, hemorragias, edema no olho, e no coração (Fig. 1).
Figure 1

Fig. 1. Efeito da presença do benzo(e)pireno em ovos embrionados. Imagens mostrando a diferença entre o olho rudimentar (setas) do embrião que desenvolveu de 48 a 56h em presença de benzo(e)pireno ou não (basal). Observe que os contornos internos do cálice óptico do embrião basal são nítidos, diferentes dos que desenvolveram em presença do benzo(e)pireno. N= 5.
Os presentes resultados indicam uma ação do inibidor benzo(e)pireno em mais de um sítio. A frequência de cálices ópticos atípicos foi dependente da concentração, e esses dados foram ajustados em uma curva sigmoide com um excelente coeficiente de correlação (R2 = 0,96). O logaritmo da concentração que reduziu em 50% a frequência de cálices ópticos atípicos, -logIC50, foi igual a 4,12 ±0.05. A inclinação da curva forneceu um número de Hill igual a -1,319, o qual indica cooperatividade, e, portanto, a ligação em mais de um sítio (Fig. 2).

Investigamos o efeito de diferentes doses de melatonina na curva dose resposta de benzo(e)pireno. Melatonina nas doses aplicadas (0.01 µM/ 10 µl; 1 µM/ 10 µl; 100 µM/ 10 µl) não alterou nenhum caractere morfológico externo do embrião. Nesses experimentos não foram usadas doses de benzo(e)pireno acima de 400 µM/10 µl. Resultados mostraram que melatonina diminui, dependendo de concentração, a frequência de cálices ópticos atípicos produzida por benzo(e)pireno (Fig. 2).


Figura 2


Fig.1. Melatonina, dependendo da concentração, altera a frequência de embriões com cálice óptico malformados, a qual depende da concentração de benzo(e)pireno. Ovos embrionados de galinha encubados a 48h receberam na câmera de ar as diferentes concentrações de benzo(e)pireno, antecedidas, ou não, pelas diferentes concentrações de melatonina, a qual foi aplicada 10 minutos antes. Cada ponto da curva concentração resposta de benzo(e)pireno corresponde a 5 embriões. Amostra de cada ponto onde houve adição de melatonina, 3 embriões.

CONCLUSÃO:
Resultados indicam que melatonina pode estar atuando via receptores de membrana, mas deve-se investigar uma ação via a enzima NRH: quinone reductase, a qual é um homodímero, inibido tanto por melatonina quanto por benzo(e)pireno (Sampaio et al., 2014). Assim, concluímos que o benzo[e]pireno altera a formação do olho, por uma via ainda desconhecida, a qual é inibida por melatonina, por um mecanismo ainda em investigação.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


  1. Anwer J, Mehrotra NK. Teratogenic effects of benzo[a]pyrene in developing chick embryo. Toxicol Lett, 1988, 40: 195-201.

  2. Fuhrmann, S. Eye Morphogenesis and Patterning of the Optic Vesicle. Curr. Top. Dev. Biol., 2010, 93, 61–84.

  3. Hoffman DJ, Gay ML. Embryotoxic effects of benzo[a]pyrene, chrysene, and 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in petroleum hydrocarbon mixtures in mallard ducks. J Toxicol Environ Health., 1981, 7:775-787.

  4. Hamburger V, Hamilton, HL (1951). A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn., 1992, 195: 231-272, 1992.

  5. Jockers R, Delagrange P, Dubocovich ML, Markus RP, Renault N, Tosini G, Cecon E, Zlotos DP (2016). Update on melatonin receptors: IUPHAR Review 20. Br J Pharmacol., 2016, 173: 2702-2725.

  6. Johnson, S., Persson, Y., Frankki, S., van Babel, B., Lundstedt, S., Haglund, P., Tysklind, M. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in contaminated soils by Fenton’s reagent: a multivariate evaluation of the importance of spoil characteristic and PAH properties. J Hazard Mater., 2007, 149, 86-96.

  7. Oga, S. Fundamentos da Toxicologia. São Paulo: Ateneu, 2006.

  8. Stoncius D, Lazutka JR. Spontaneous and benzo[a]pyrene-induced micronuclei in the embryos of the black-headed gull (Larus ridibundus L.). Mutat Res., 2003, 538: 31-39.

  9. Sampaio, LF, Hamassaki-Britto, DE, Markus, RP. Influence of melatonin on the development of functional nicotinic acetylcholine receptors in cultured chick retinal cells. Braz J Med Biol Res., 2005, 38: 603-613.

  10. Sampaio, Lde F. Melatonin inhibitory effect on cAMP accumulation in the chick retina development. Int J Dev Neurosci., 2008, 26: 277-282.

  11. Sampaio, Lde F. An unexpected effect of 5-MCA-NAT in chick retinal development. Int J Dev Neurosci., 2009, 27: 511-515.

  12. Sampaio Lde F, Markus RP. Melatonin and the time window for the expression of the alpha8 nicotinic acetylcholine receptor in the membrane of chick retinal cells in culture. Int J Dev Neurosci., 2010, 28: 245-249.

  13. Sampaio Lde F, Mesquita FP, de Sousa PRM, Silva JL, Alves CN. The melatonin analog 5-MCA-NAT increases endogenous dopamine levels by binding NRH: quinone reductase enzyme in the developing chick retina. Int J Dev Neurosci., 2014, 38: 119-126.

  14. Silva RN, Sampaio Lde F (2014). Immunoreactivity of Mel1a-like melatonin receptor and NRH: Quinone reductase enzyme (QR2) in testudine whole embryo and in developing whole retinas. Trends Dev Biol., 8, 39-46.


PUBLICAÇÕES:

Está sendo preparado resumo para submissão em congresso nacional.


ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES:

  1. Leitura e apresentação de artigos científicos.

  2. Experimentos com 6-cloromelatonina, o qual é um agonista de receptores de melatonina, e não possui ação antioxidante.

  3. Experimentos com 5-MCA-NAT, análogo de melatonina que ativa a enzima NRH: quinona redutase que é inibida por benzo(e)pireno.

  4. Publicações.


DIFICULDADES

Neste semestre houve quedas de energias e falta de água dificultando o desenvolvimento do embrião e a evolução do experimento. Houve também incidências de ovos não embrionados.



PARECER DO ORIENTADOR:
Aluno regular.

DATA: 24/Fevereiro/2017

Lucia de Fatima Sobral Sampaio

ASSINATURA DO ORIENTADOR

Reginaldo Almeida Magno Júnior

ASSINATURA DO ALUNO







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