Relatório técnico científico período: Setembro/2014 a Agosto/2015



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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA


PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Setembro/2014 a Agosto/2015

(X) PARCIAL

( ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): ANÁLISES FITOQUÍMICA, FARMACOGNÓSTICA E FARMACOLÓGICAS DE ESPÉCIES AMAZÔNICAS: Petivera alliacea L. e Eupatorium ayapana V.


Nome do Orientador: Marcieni Ataíde de Andrade
Titulação do Orientador: Doutora
Faculdade: Farmácia
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências da Saúde (ICS)
Laboratório: Farmacognosia
Título do Plano de Trabalho: Ensaios espectrométricos e avaliação toxicológica de fração rica em cumarinas obtidas de Eupatorium ayapana V.
Nome do Bolsista: Daniele Hidemi Okabe
Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq

( ) PIBIC/CNPq – AF

( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador

( ) PIBIC/UFPA

(X) PIBIC/UFPA – AF

( ) PIBIC/ INTERIOR

( )PIBIC/PARD

( ) PIBIC/PADRC

( ) PIBIC/FAPESPA

( ) PIBIC/ PIAD

( ) PIBIC/PIBIT

INTRODUÇÃO
A utilização de plantas e produtos naturais no tratamento de doenças é uma prática que sempre esteve presente no decorrer da história da humanidade. O emprego de plantas medicinais para a manutenção e a recuperação da saúde tem ocorrido ao longo dos tempos, desde as formas mais simples de tratamento local até as formas tecnologicamente sofisticadas de fabricação industrial (SOUZA E LORENZI, 2008). As plantas medicinais apresentam ampla diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades biológicas (VON POSER e MENTZ et al. 2004). E mediante o consumo cada vez mais frequente de plantas medicinais, sob forma de chás e/ou cápsulas, estudos devem ser desenvolvidos a fim de avaliar a sua composição (ANDRADE et al. 2005). E para assegurar o uso seguro das plantas medicinais, deve-se submetê-las a testes de eficácia e segurança por métodos recomendados pela legislação (BRASIL, 2004). Nesse contexto, a investigação do potencial toxicológico de plantas medicinais pode contribuir com aspectos farmacológicos de seus princípios naturais, permitindo uma utilização segura, avaliando seus possíveis riscos (AMARAL e SILVA, 2008).

Asteraceae é uma das maiores famílias de plantas, que compreende cerca de 1.600 gêneros e 23.000 espécies (ANDENBERG et al. 2007). Esta família pode ser considerada uma das mais importantes fontes de espécies vegetais de interesse terapêutico (JUDD et al., 2002). Na região amazônica, Eupatorium ayapana Veuten é uma das espécies da família bastante utilizada com fins terapêuticos, possuindo atividade antimicrobiana (GUPTA et al. 2002) e antioxidante (BEPARI et al. 2013). Eupatorium triplinerve e Ayapana triplinervis são sinonímias da espécie, que na região é conhecida popularmente como Japana.

Estudos acerca da espécie E. ayapana apontam que os principais constituintes químicos identificados pertencem a classe de cumarinas obtidas de extratos de diferentes polaridades e de derivados terpênicos e oxigenados obtidos a partir do óleo essencial. (CHATURVEDI e MULCHANDANI, 1989; GUPTA et al. 2004; GAUVIN-BIALECKI E MARODON, 2009). Os constituintes químicos que já foram isolados e identificados pertencem majoritariamente à classe das cumarinas (CHATURVEDI e MULCHANDANI, 1989; NATAJARAM e NATAJARAM, 1979; BOSE e ROY, 1936, GARG e NIGAM, 1970; TRANG et al. 1992, 1993). Ao todo, sete tipos de cumarinas foram isolados em E. ayapana: a ayapanina, ayapina, dafnetina, éter dimetil dafnetina, éter 7-metildafnetina, hidragetina e umbeliferona. (GAUVIN-BIALECKI, 2009; TAYLOR, 2006).

JUSTIFICATIVA
A ampliação das opções terapêuticas ofertadas a população, com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade da atenção à saúde, é uma importante estratégia com vistas à melhoria da atenção à saúde da população e a inclusão social. Tratando-se de uma prática que estimula a participação direta da população no processo saúde-doença, propomos realizar uma avaliação de espécies amazônicas sobre o sistema nervoso central enfocando análises comportamentais, fitoquímicas e antioxidantes. Quanto mais detalhadas forem as informações, maiores serão as chances da pesquisa trazer subsídios de interesse para se avaliar não somente a eficácia, mas garantir segurança ao uso de plantas medicinais e dos seus produtos fitoterápicos.

Sabe-se que o Brasil é o país de maior biodiversidade do planeta que, associada a uma rica diversidade étnica e cultural detém um valioso conhecimento tradicional associado ao uso de plantas medicinais, tendo o potencial necessário para desenvolvimento de pesquisas em tecnologias e terapêuticas apropriadas.

Dentre o arsenal da biodiversidade da flora encontrado na região amazônica destacamos as espécies medicinais encontradas na região do estado do Pará, com sua amplitude para tratar diversos males, enfermidades entre outros usos. Muitas destas plantas possuem alegação de uso para atuarem no Sistema Nervoso Central (SNC) como Mucuracaá, Japana, Marapuama, entre outras. Tais alegações precisam ser confirmadas a fim de contribuírem para a utilização segura e eficaz das espécies medicinais. Estudos na área comportamental com plantas da biodiversidade amazônica são escassos, evidenciando uma lacuna no conhecimento científico da utilização de espécies nativas da região amazônica.

Sendo estudo de utilização de plantas medicinais estratégico para nosso país, este projeto propõe através de suas ações, auxiliar no aprimoramento desta ação governamental e contribuir para o conhecimento e a prática utilizada pela população amazônica, viabilizando não apenas maior acesso a medicamentos, mas também garantir maior confiabilidade no uso seguro e aos possíveis riscos à saúde.

Como o desenvolvimento do projeto proposto, os resultados obtidos pela equipe poderão beneficiar toda a população amazônica que faz uso de plantas medicinais no tratamento de diversas enfermidades através da prática popular. Assim como os órgãos da área da saúde e mesmo ambientais do Estado do Pará que poderão utilizar os resultados como subsídios na avaliação da utilização de tais plantas. Um dos objetivos maiores deste trabalho é fornecer dados que possam servir de suporte para programas de produção de fármacos e certificação de produtos naturais, garantido a melhoria da qualidade de vida da população.

Desta forma, este projeto pleiteia dentro do seu contexto se unir as linhas e diretrizes da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, aprovada por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006, que estabelece objetivos comuns voltados à garantia do acesso seguro e uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos em nosso país, ao desenvolvimento de tecnologias e inovações, assim como ao fortalecimento das cadeias e dos arranjos produtivos, ao uso sustentável da biodiversidade brasileira e ao desenvolvimento do Complexo Produtivo da Saúde.


OBJETIVOS
Objetivo geral:
Caracterizar por diferentes técnicas espectrométricas fração rica em cumarinas obtida de Eupatorium ayapana V. e avaliar a toxicidade aguda.
Objetivos específicos:


  • Obter extratos de diferentes polaridades de partes aéreas (folhas e talos): atividade realizada;

  • Selecionar extrato para obtenção de fração rica em cumarinas: atividade realizada;

  • Realizar o fracionamento dos extratos por Cromatografia em Coluna: atividade realizada;

  • Traçar o perfil cromatográfico das frações por Cromatografia de Camada Delgada e selecionar fração cumarínica: atividade realizada;

  • Determinar o teor cumarina da fração selecionada por espectrofotometria: atividade não desenvolvida por falta de recursos par aquisições de padrões analíticos, em compensação foi realizado uma varredura espectral das frações;

  • Obter espectro de infravermelho (IV) da fração rica em cumarina: a atividade deve ser desenvolvida nos próximos seis meses do cronograma previsto;

  • Obter espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) da fração rica em cumarina: a atividade deve ser desenvolvida nos próximos seis meses do cronograma previsto;

  • Avaliar a toxicidade oral aguda das frações ricas cumarínicas em camundongos: a atividade deve ser desenvolvida nos próximos seis meses do cronograma previsto.


MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta e identificação do material vegetal

A espécie Eupatorium ayapana V. foi coletada em abril de 2014 no município de Acará-PA. Amostras do material vegetal foram selecionadas para preparação de exsicatas que tiveram identificação botânica realizada por especialistas do Herbário João de Mursa Pires do Museu Paraense Emílio Goeldi, onde se encontra depositada com o número de registro MG123913.


Obtenção da droga vegetal
As partes aéreas do material vegetal foram cuidadosamente selecionadas, lavadas com água corrente e submetidas à secagem em temperatura ambiente por 24 horas e estufa com fluxo de ar forçado (40ºC) durante 48 horas. O material resultante foi pulverizado em um moinho de facas para obtenção da droga vegetal.
Preparação de extratos de diferentes polaridades
A droga vegetal foi submetida à extração consecutiva com solventes em ordem crescente de polaridade (Hexano, Acetato de etila e Metanol), através do processo de maceração. Os extratos obtidos foram concentrados em evaporador rotativo para eliminação dos solventes.
Prospecção fitoquímica por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e seleção do extrato para fracionamento

Os diferentes extratos obtidos foram submetidos a teste de prospecção fitoquímica por CCD para detecção de cumarinas (WAGNER E BLADT, 2001). Os extratos foram diluídos em metanol (1 mg/mL) e submetidos à análise em cromatoplacas de alumínio recobertas por sílica gel 60G F254 Merck, sendo empregado como eluente tolueno-éter (1:1 saturado com ácido acético a 10%) e visualizada em câmara escura sob luz UV de 365 nm. Utilizou-se como revelador a solução etanólica de KOH a 5% e em seguida, observou-se sob luz UV de 365 nm. A cumarina 1,2-benzopirona foi utilizada como padrão. O extrato com melhor perfil cromatográfico para cumarinas foi selecionado para a obtenção de fração rica em cumarina.



Fracionamento dos extratos

A Cromatografia em Coluna foi realizada para fracionamento do extrato que apresentou o melhor perfil de cumarinas na CCD. Para isso, utilizou-se uma coluna de vidro preenchida por sílica gel 60 (70-230 mesh ASTM) e a eluição foi realizada com diferentes proporções dos solventes hexano, acetato de etila e metanol. Os parâmetros utilizados neste fracionamento estão detalhados no Quadro 1. As frações foram concentradas em evaporador rotativo.


Quadro 1. Parâmetros utilizados para fracionamento do extrato de acetato de etila por CLC.

Parâmetros

Especificações

Altura da coluna

40 cm

Diâmetro da coluna

4 cm

Massa de sílica gel

100 g

Amostra de extrato

4,5 g

Fase móvel

  1. Hexano:acetato de etila (9:1)

  2. Hexano:acetato de etila (7:3)

  3. Hexano:acetato de etila (1:1)

  4. Acetato de etila (100%)

  5. Acetato de etila:metanol (1:1)

  6. Metanol:acetato de etila (7,5:2,5)

  7. Metanol (100%)

Volume de fase móvel

500 mL



Perfil cromatográfico das frações
Baseados em métodos proposto por Wagner e Bladt (2001) e Costa (1987), foi realizado um perfil de detecção cromatográfica por CCD nas frações para detecção de cumarinas. O sistema de solvente utilizado foi hexano:acetato de etila (8:2) sob luz UV-365 nm a fim de detectar a presença de cumarinas, que é evidenciada pela formação de mancha verde-fluorescente e/ou a azul-fluorescente. As frações que apresentaram estas manchas foram selecionadas para a continuidade das análises.
Varredura Espectral
O extrato de acetato de etila e as frações diluídos em metanol para concentração de 1 mg/mL foram submetidos à uma varredura em espectrofotômetro (PerkinElmer/Lambda 950) no intervalo de comprimento de onda entre 700 a 190 nanômetros (nm) com diminuição regressiva de 0,1 nm, modo leitura rápida, utilizando cubetas de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Rendimento dos extratos
Os rendimentos dos extratos são demostrados na Tabela 2. Observa-se que o metanol apresentou o maior rendimento, permitindo sugerir que a planta possua em maiores quantidades constituinte com alta polaridade. Em contrapartida, o hexano apresentou o menor rendimento, evidenciando menor quantidade de constituintes com baixa polaridade.
Tabela 1. Rendimento percentual (m/v) dos extratos obtidos.

Extrato

Rendimento

Hexano

1,16%

Acetato de etila

2,29%

Metanol

5,17%



Prospecção fitoquímica por CCD
O perfil cromatográfico do padrão de cumarina e dos extratos é apresentado na Figura 1. Observa-se na Figura 1.A. a presença de mancha azul-fluorescente nas aplicações dos extratos. A Figura 1.B. exibe a placa após revelação com KOH 5%, no qual, observa-se o padrão de cumarina com mancha verde fluorescente e os extratos com mancha azul-fluorescente. Segundo Wagner e Bladt (2001) as cumarinas substituídas podem ser visualizadas na cor azul-verde brilhante sob luz UV 365 nm, diferentemente das cumarinas simples que somente apresentam fluorescência após tratamento com KOH, na cor verde-fluorescente. As cumarinas constituem uma classe de compostos representada por derivados de 1-benzopiran-2-ona, sendo este o representante mais simples (cumarina simples), quando o esqueleto estrutural de 1-benzopiran-2-ona se encontra com distintos grupos químicos substituintes nas cadeias laterais são consideradas cumarinas substituídas (CASSINI, 2010). Os substituintes podem alterar as propriedades químicas do composto, o que justifica a mudança no perfil cromatográfico dos extratos de A. triplinervis. Logo, infere-se que as cumarinas presentes nos extratos e droga vegetal podem ser cumarinas substituídas.

O extrato de acetato de etila apresentou bandas de coloração mais intensa, sendo considerado o melhor perfil cromatográfico para cumarinas, e selecionado para o fracionamento em Cromatografia em Coluna.



A B C D

A B C D





A

B


Figura 1. Perfil cromatográfico obtido por CCD dos diferentes extratos e padrão de cumarina. A: Visualizado sob luz UV de 365nm; B: Visualizado sob luz UV 365 nm após revelação com solução etanólica KOH 5% (m/v).

A: Extrato hexânico; B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato metanólico; D: Padrão (1,2-benzopirona 1mg/mL)





Perfil cromatográfico das frações
O perfil cromatográfico das frações pode ser visualizado na Figura 9. Obteve-se um total de 13 frações, observa-se que as frações de 4 a 10 apresentaram duas manchas sugestivas de cumarinas, uma verde-fluorescente de menor intensidade e outra azul-fluorescente de maior intensidade, sugerindo a presença de diferentes tipos de compostos cumarínicos.

Fr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Figura 2. Perfil cromatográfico por CCD das frações obtidas por Cromatografia em Coluna sob luz UV 365 nm.


As frações foram reunidas conforme semelhanças nas características cromatográficas por CCD e no perfil de pigmentação das frações em luz visível (Tabela 5). As frações em que foram detectadas cumarinas, após reunião, foram submetidas à varredura espectral.
Tabela 2. Reunião e rendimento em miligramas (mg) das frações obtidas por CLC.

Frações

Rendimento (mg)

Frações 1 e 2

599

Fração 3

518

Fração 4

201

Fração de 5 a 9

1431

Fração 10

1036

Fração 11,12,13

176



Varredura espectral
A varredura espectral realizada com o extrato de acetato de etila no comprimento de onda de 190 a 700 nm está apresentada na figura 10. O pico de absorbância no comprimento de onda de 201 nm foi desconsiderado na análise, pois o metanol, solvente utilizado para diluir as amostras possui absorbância máxima em torno de 205 nm (SNYDER et al. 2010). Assim, observa-se a presença de quatro picos de absorbância característicos de derivados cumarínicos, sendo eles no comprimento de onda de 233 nm, 293 nm, 346 nm e 408 nm (BATH et al. 2011).

Figura 3. Varredura espectral do Extrato de Acetato de Etila no comprimento de onda de 190 a 700 nm. A = absorbância.


A figura 4 apresenta o perfil espectral do extrato de acetato de etila e das frações em que foram detectadas cumarinas. Observa-se que a fração reunida (5 a 9), apresentou picos de absorbância elevados em regiões características de derivados cumarínicos (BATH et al. 2011). Enquanto a fração 4 e a fração 10 apresentaram picos de absorbância baixos nessas regiões. Permitindo inferir que o fracionamento foi efetivo e que a fração rica em cumarinas é a fração reunida (5 a 9).

Figura 4. Varredura espectral do extrato de acetato de etila e das frações obtidas por Cromatografia em Coluna no comprimento de onda de 190 a 700 nm. A: absorbância.


A figura 5 apresenta o perfil espectral da fração rica em cumarinas. Observa-se que a fração apresentou picos de absorbância elevados em regiões características de derivados cumarínicos, como a escopoletina e ayapina (SEN e BAGCHI, 1959). Ao todo, sete tipos de cumarinas foram isolados em E. ayapana: a ayapanina, ayapina, dafnetina, éter dimetil dafnetina, éter 7-metildafnetina, hidragetina e umbeliferona (GAUVIN-BIALECKI, 2009; TAYLOR, 2006). Neste sentido, possivelmente a fração rica em cumarinas seja composta majoritariamente por ayapina, pois a escopoletina nunca foi isolada em E. ayapana. Este dado evidencia a necessidade da realização de novas análises, como a obtenção de espectros de IV e de RMN, para a identificação do composto majoritário.

Figura 5. Varredura espectral das frações rica em cumarinas (5 a 9) no comprimento de onda de 190 a 700 nm. A: absorbância.



PUBLICAÇÕES
O trabalho intitulado como: Avaliação fitoquímica de Ayapana Triplinervis (Asteraceae) por Cromatografia de Camada Delgada, foi apresentado e publicado nos anais do IV Congresso de Educação em Saúde na Amazônia, no qual foi ganhador do 2º lugar do curso de farmácia como apresentador de pôster.



ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES
Durante o período inicial todas as atividades com adaptações do plano de trabalho puderam ser realizadas, conforme previsto para os primeiros meses. Portanto, com a obtenção da fração rica em cumarinas, poderão ser realizadas as demais etapas, tais como obtenção dos espectros IV e RMN e a avaliação da toxicidade oral.

REFERÊNCIAS
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DIFICULDADES

O plano de trabalho teve que passar por modificações por falta de equipamentos e materiais, bem como, a falta de recursos para aquisição dos mesmos, dificultando o seu processo de execução.


DATA : ______/_________/________

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ASSINATURA DO ORIENTADOR

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ASSINATURA DO ALUNO










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