Relatório técnico científico período: Agosto / 2015 a Fevereiro / 2016



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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA


PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Agosto / 2015 a Fevereiro / 2016

( x ) PARCIAL

( ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Rede de pesquisas aplicadas para suporte ao desenvolvimento integrado e sustentado da pesca e aquicultura no Estado do Pará " Estudo do crescimento, reprodução e alimentação de Crassostrea gasar (ADANSON, 1757), no estuário paraense"


Nome do Orientador: Maria Auxiliadora Pantoja Ferreira
Titulação do Orientador: Doutora em Ciências
Faculdade: Faculdade de Biologia
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Laboratório de Imunohistoquímica e Biologia do Desenvolvimento
Título do Plano de Trabalho: Efeito da matriz extracelular na maturação ovariana da ostra Crassostrea gasar cultivada no Município de Augusto Corrêa- PA.
Nome do Bolsista: Luiz Fernando Silva Oliveira
Tipo de Bolsa : ( X ) PIBIC/ UFPA

RESUMO DO RELATÓRIO ANTERIOR
Crassostrea gasar é uma espécie de ostra nativa que vem sendo cultivada por pescadores locais na região Norte, no estado do Pará. Em se tratando das fêmeas de C. gasar, as gônadas são formadas por oogônias e oócitos que variam de forma e tamanho de acordo com o grau de maturidade do órgão. Em face à importância socioeconômica de moluscos bivalves, em especial C. gasar, são expressivos os trabalhos sobre o cultivo de ostras e as influências de fatores abióticos, entretanto, dados sobre a biologia reprodutiva com ênfase na análise ovariana que descreva a morte celular nos oócitos ainda são desconhecidos. Desse modo, o presente trabalho objetivou informar sobre a atividade apoptótica durante a maturação ovariana de C. gasar cultivada na vila de Nova Olinda (PA), de onde foram coletados 240 exemplares de ostras de janeiro á dezembro de 2010 e conduzidos vivos ao laboratório. Em seguida as ostras eram abertas e fragmentos das gônadas eram retirados para processamento histológico de rotina em microscopia de luz (ML) e imunohistoquímica. Através da ML foram descritos quatro estádios ovarianos: imaturo, com grande quantidade de tecido conjuntivo e folículos pequenos contendo oogônias e oócitos pré-vitelogênicos; em maturação que apresentava menor quantidade de manto e folículos irregulares com oócitos pré-vitelogênicos e o predomínio de oócitos em vitelogênese; maturo caracterizado pela presença de folículos maiores com o predomínio de oócitos vitelogênicos e alguns em vitelogênese, e desova com predomínio de oócitos em vitelogênese. Através da imunohistoquímica foi analisada expressão da caspase-3 clivada nos quatro períodos de maturação de C. gasar. O imaturo apresentou imunorreação em algumas células foliculares, oogônias e oócitos pré-vitelogênicos. No estádio em maturação e maturo, observou-se a reação apenas nas células foliculares e raras vezes nos oócitos. O estádio desovado apresentou reação em vários oócitos. Os resultados descrevem apoptose atingindo principalmente o estádio de desova. Essa condição pode estar associada aos fatores intrínsecos, como hormônios e fatores extrínsecos como a salinidade. Com esses dados podemos destacar a importância em descrever e conhecer a estrutura gonadal de ostras em um ambiente de cultivo, servindo assim de subsídio para trabalhos futuros cujo ambiente sofre ação de poluentes orgânicos e inorgânicos.

INTRODUÇÃO

A organização do tecido animal é constituída pela interação célula-célula e célula-matriz extracelular. Em se tratando da matriz extracelular (MEC) a disposição e o arranjo dos seus componentes promovem a sustentação das células e condições adequadas para o crescimento, diferenciação e manutenção das mesmas (SCHUPPAN & RUHL, 1994; ALBERTS, 1997).

A MEC é constituída por uma variedade de macromoléculas (proteoglicanas glicosaminoglicanas) além das proteínas fibrosas (colágeno e elastina) que desempenham a função estrutural, e as glicoproteínas adesivas como laminina e fibronectina, que proporcionam a adesão da célula à matriz e estão presentes na lâmina basal ou lâmina externa das células (POTTS & CAMPBELL, 1996; BORNSTEIN, 2002; PEREIRA et al., 2005).

Os componentes da MEC formam um sistema dinâmico e interativo que informa as células sobre as mudanças bioquímicas e mecânicas, possui efeito regulatório sobre o desenvolvimento embrionário e diferenciação celular, sendo capaz de controlar o crescimento e proliferação celular; além de atuar na sustentação, promovendo a adesão da célula ao tecido circundante (BRUIJN et al., 1988; ROSS & PAWLINA, 2011).

A ostra-do-mangue Crassostrea gasar, é uma ostra nativa e vem sendo cultivada na região Norte, especialmente na vila de Nova Olinda-PA (SAMPAIO & BOULHOSA, 2007). Moluscos bivalves, em especial C. gasar são ostras de grande interesse econômico além de exercerem importante papel para os ecossistemas de manguezais (SILVA, 2004; FUNES et al., 2006; CHRISTO & ABSHER, 2008).

Informações sobre o efeito da fibronectina e laminina no desenvolvimento folicular e maturação oocitária, são promissoras em vertebrados incluindo os peixes (THOMÉ et al., 2010) mas são limitadas em invertebrados, como moluscos (PARANKO et al., 1983). Nesse contexto, o estudo pretende investigar o papel destas glicoproteínas durante a maturação ovariana da ostra Crassostrea gasar a fim de se conhecer quais as suas influências no processo reprodutivo da espécie.


JUSTIFICATIVA

Durante o desenvolvimento ovariano e ao longo de todo o ciclo reprodutivo, o parênquima ovariano passa por constante remodelamento, com intensa proliferação e diferenciação de células, além de modificações na sua matriz extracelular (CURRY & OSTEEN, 2003; THOMÉ et al., 2010). Entretanto, estudos relacionando os efeitos da MEC durante a maturação ovariana de C. gasar ainda são limitados na literatura. Desse modo esse trabalho procura investigar essa relação, a fim de elucidar o processo de organogênese nesse grupo de animais.



OBJETIVOS

Objetivo Geral:
Determinar a ação da matriz extracelular no ovário de Crassostrea gasar.

Objetivos específicos:
1- Observar a imunolocalização da laminina nos oócitos de C. gasar.

2- Observar a imunolocalização de fibronectina no ovário de C. gasar.




MATERIAL E MÉTODOS
Área de Estudo
A área de estudo foi o Rio Emboraí no trecho que compreende a Vila de Nova Olinda no Município de Augusto Corrêa, nordeste do Estado do Pará. Localizada a 228 km de Belém, a área possui como coordenadas geográficas centrais 0º 52’ 54 “S e 46º 26’ 54” W. É neste local que vem sendo realizado o cultivo natural de C. gasar, espécie conhecida vulgarmente como “ostra-do-mangue” (Figura 1).




Figura 1 - Mapa do litoral amazônico oriental em destaque, indicando a posição do rio Emboraí (seta), onde está localizada a fazenda marinha da AGRONOL.

Fonte: Modificado de NOAA (National Oceanic Atmospheric Administration), 2010.





Obtenção de exemplares
Foram realizadas coletas mensais de 20 exemplares no período de janeiro a dezembro de 2010. Os exemplares apresentavam tamanhos aleatórios, a partir de 1 cm de altura (distância linear entre o umbo e a abertura da concha). Após a coleta, as amostras foram transportadas em recipientes contendo água do próprio local para o Laboratório de Imunohistoquímica e Biologia do Desenvolvimento do ICB/UFPA, onde foi realizada a biometria (peso, comprimento e altura), com auxílio de uma balança analítica e um paquímetro digital. Posteriormente, as gônadas foram retiradas e processadas para as técnicas de microscopia.
Microscopia de luz
Em virtude de os animais não apresentarem um dimorfismo sexual, há necessidade da técnica histológica para identificação do sexo. As gônadas foram fixadas em solução de Bouin por 24 horas, e processadas pelas técnicas histológicas de rotina para a inclusão em parafina. Em seguida foram realizados cortes de 5μm de espessura que foram desparafinizados em xilol, reidratados em concentrações decrescentes de etanol e corados pela Hematoxilina-Eosina (PROPHET et al., 1995).
Imunohistoquímica
Para determinar a imunolocalização das proteínas fibronectina réplicas das lâminas contendo fragmentos do ovário previamente identificado pela microscopia de luz foram desparafinizadas em xilol, reidratadas em etanol, lavadas em solução salina tamponada (PBS) e incubadas em peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram imersas em tampão citrato de sódio aquecido a 70°C durante 25 minutos e bloqueadas com soro normal de cabra (16210072, Invitrogen, Burlington, ONT, Canada) a 10% por 1 hora. As lâminas foram incubadas em “overnigth” com anticorpo primário policlonal anti-fibronectina de coelho (AB3623, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) na diluição de 1:100. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em PBS tween 0,05% (TWEEN 20, 25564, E.M.S., Hatfield, PA.) e pós-incubadas em anticorpo secundário IgG anti-coelho conjugado com peroxidase (sc-2030, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europe) diluído em 1:500 por 2 horas. A reação foi revelada em solução de DAB (3,3’ diaminobenzidina) (750118, Invitrogen, Burlington, ONT, Canada) por 5 minutos, lavada em água destilada e analisadas e fotografadas em fotomicroscópio (NIKON Eclipse Ci-E, Nikon Corporation, Tóquio, Japão) acoplado à uma câmera digital (NIKON DS-Ri1, Nikon Corporation, Tóquio, Japão). Para o controle negativo não foi utilizado anticorpo primário e em substituição, as lâminas foram incubadas em PBS.


RESULTADOS

Até o presente momento foi realizado o levantamento bibliográfico, além de processamentos histológicos e imunohistoquímica para proteína fibronectina.

Nas ostras é possível identificar estádios reprodutivos de acordo com os tipos celulares presentes nos folículos ovarianos. Foi observada intensa imunorreação dos folículos nos estádios imaturo, em maturação, desova e nos limites do tecido conjuntivo também denominado de manto, enquanto no estágio maduro a reação foi limitada preferencialmente em torno do folículo (figura 2).



Figura 2- Fotomicrografia do ovário de C. gasar em diferentes estádios de maturação marcada com fibronectina. A- Controle Negativo (Estádio Em Maturação) B- Em Maturação. C- Maduro. D- Desova. Células foliculares (seta vermelha), oogônias (seta preta), oócitos pré-vitelogênicos (seta pontilhada), em vitelogênese (ev), maduros (m), manto (M). A-D 400x, D-E 1000X.

Em peixes a fibronectina foi localizada nas células foliculares de folículos pos ovulatórios (THOMÉ et al., 2010), o mesmo foi observado em células granulosas de mamiferos estabelecendo assim que essas células possuem o papel de síntese de componentes da matriz extracelular (ZHAO & LUCK 1995). Analisando os estágios de maturação em ostras encontramos a elevada intensidade de reação para a fibronectina principalmente nos oócitos em vitelogênese dos estágios imaturo e desova, sugerindo que essa glicoproteína seja produzida por essas células e que participa intensamente na proliferação celular e remodelação tecidual.


PUBLICAÇÕES

No período referente a essa primeira etapa da pesquisa não houve publicação, porém, a obtenção destes resultados já estão sendo organizados e serão apresentados em reuniões científicas.


ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES


  1. Levantamento bibliográfico sobre os pontos chave do trabalho;

  2. Imunomarcação para laminina em todos os estádios ovarianos de C. gasar;

  3. Elaboração de resumos para apresentação em reuniões científicas;

  4. Elaboração do relatório final.


REFERÊNCIAS
ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. 5ª Edição: Artmed Editora, Porto Alegre – RS, 2009.
BORNSTEIN, P.; SAGE, E.H. Matricellular proteins: extracellular modulators of cell function. Current opinion in cell biology, v. 14, n. 5, p. 608-616, 2002.
BRUIJN,J.; HOGENDOORN, P.C.W.; HOEDEMAEKER, P.J.; FLEUREN, G.J. the extracelular matrix in pathology. J.Lab. Clin, Med 111(2):140-149,1988.
CHRISTO, S. W.; ABSHER, T. M. Crescimento da prodissoconcha de ostras do gênero Crassostrea SACCO, 1897 (BIVALVIA, OSTREIDAE). Boletim do Instituto da Pesca, São Paulo (SP), v. 34, n.1, 71-77, 2008.
CURRY JR, T.E.; OSTEEN, K.G. The matrix metalloproteinase system: changes, regulation, and impact throughout the ovarian and uterine reproductive cycle. Endocrine Reviews, v. 24, n. 4, p. 428-465, 2003.
FUNES, V.; ALHAMA, J.; NAVAS, J. I.; LO´ PEZ-BAREA, J.; PEINADO, J. Ecotoxicological effects of metal pollution in two mollusc species from the Spanish South Atlantic littoral. Environmental Pollution, v. 119, 214-223p, 2006.
PARANKO, J. et al. Morphogenesis and fibronectin in sexual differentiation of rat embryonic gonads. In: Mechanisms of Gonadal Differentiation in Vertebrates. Springer Berlin Heidelberg, 1983. p. 72-81.
PEREIRA, A.L.A. et al. O papel das proteínas da matriz extracelular e das metaloproteinases em carcinomas de cabeça e pescoço: uma atualização bibliográfica. Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, v. 71, n. 1, p. 81-6, 2005.
POTTS, J.R.; CAMPBELL, I.D. Structure and function of fibronectin modules. Matrix Biology, v. 15, n. 5, p. 313-320, 1996.
PROPHET, E.B. Métodos Histotecnológicos. Washington (DC): Instituto de Patologia de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de America (AFIP), 1995. 280p.
ROSS, M.H; ROSS, W. Histologia - Texto e Atlas. 5ª Edição: Guanabara Koogan, São Paulo – SP, 2011.
SAMPAIO, D.S.; BOULHOSA, R.L.M. Energia que vem da ostra: do extrativismo para o cultivo. In: DUARTE, R. B. A. Histórias de Sucesso: Agronegócios - Aqüicultura e Pesca. SEBRAE, Brasília (DF), 2007, p. 143-160.
SILVA, A. Z. Avaliação de biomarcadores bioquímicos na ostra do mangue (Crassostrea rhizophorae) (MOLLUSCA: BIVALVIA) exposta a óleo diesel em diferentes salinidades. Dissertação (Mestrado), Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. 40p, 2004.
SCHUPPAN, D.; RÜHL, M. Matrix in signal transduction and growth factor modulation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 27, n. 9, p. 2125-2141, 1994.
THOMÉ, R. et al. Distribution of laminin β2, collagen type IV, fibronectin and MMP-9 in ovaries of the teleost fish. Journal of Molecular Histology, v. 41, n. 4-5, p. 215-224, 2010.
ZHAO Y, LUCK MR Gene expression and protein distribution of collagen, fibronectin and laminin in bovine follicles and corpora lutea. J Reprod Fertil 104:115–123, 1995.

DIFICULDADES
Durante o período de estudo ocorreu o atraso na entrega do anticorpo anti-laminina pela empresa, impossibilitando a realização dessa imunohistoquimica. Estamos aguardando a entrega e tão logo aconteça imediatamente procederemos tal atividade.
ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MÊSES

  1. Realização da imunomarcação para laminina.

  2. Elaboração de resumos para apresentação em reuniões científicas.

  3. Com os resultados pré existentes elaboração e submissão de artigos científicos em periódicos internacionais.


PARECER DO ORIENTADOR

O aluno Luiz Fernando Silva Oliveira desenvolveu suas atividades de modo satisfatório, demonstrando interesse e participando ativamente de todas as etapas necessárias para obtenção do resultado de seu trabalho, que incluem levantamento bibliográfico, leitura de artigos, coleta de exemplares em campo, processamento histológico e imunohistoquímico e análise do material.



Desse modo, sou de parecer favorável a aprovação do seu relatório, bem como, ao pedido de renovação da bolsa.
DATA: 29 de fevereiro de 2016

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Maria Auxiliadora Pantoja Ferreira

ASSINATURA DO ORIENTADOR




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Luiz Fernando Silva Oliveira

ASSINATURA DO ALUNO









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