Relatório técnico científico período : Janeiro/2017 a Agosto/2017



Baixar 40.02 Kb.
Encontro22.02.2018
Tamanho40.02 Kb.


UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : Janeiro/2017 a Agosto/2017

(x) PARCIAL

( ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: AVALIAÇÃO DO USO DA CICLODEXTRINA COMO AGENTES DA CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BUBALINOS
Nome do Orientador: Prof. Dr. Otávio Mitio Ohashi
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Faculdade de Biomedicina
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Laboratório de Fecundação in vitro
Título do Plano de Trabalho: OCORRÊNCIA DE APOPTOSE EM CÉLULAS DA TUBA UTERINA CULTIVADAS COM ESTRADIOL E PROGESTERONA

Nome do Bolsista: Marcielly de Fátima da Costa Lobato
Tipo de Bolsa: (x) PIBIC/ CNPq


  1. INTRODUÇÃO

O trato reprodutor feminino é constituído por ovários, útero, vagina e pelas tubas uterinas ou oviduto. Este se destaca, pois, é o local onde ocorre a capacitação espermática, o transporte dos gametas masculino e feminino, a fertilização e as primeiras divisões do zigoto (KIERSZENBAUM, 2008).

A tuba uterina é dividida em infundíbulo, ampola, istmo e uma junção útero-tubal. A sua constituição se dá através de, uma túnica serosa, túnica muscular e uma camada mucosa, que é composto por um epitélio simples cilíndrico (AVILES et al., 2015).

A tuba uterina é formada por duas populações celulares (células ciliadas e células secretoras), onde sua morfofisiologia está diretamente ligada à produção hormonal. As células ciliadas formam cílios (ciliogênese) à medida que a produção de estrógeno ocorre a partir do crescimento folicular, assim como as células secretoras (não – ciliadas) aumentam sua atividade secretora (KIERSZENBAUM, 2008).

Algumas substâncias secretadas por essas células, já foram descritas como, proteínas, fatores de crescimento, aminoácidos, piruvato, glicose, heparina. Essas substâncias vão formar um fluido viscoso presente no oviduto, que é fundamental para os eventos que ocorrem na tuba (BUHI et al., 2000; MICHAEL et al., 2014; KILLIAN, 2004).

Embora sejam estruturas fundamentais no transporte e na interação entre os gametas e para a produção de substâncias que aumentam a viabilidade de oócitos e embriões, assim como a capacitação espermática, tornando-os viáveis à fertilização, existem poucos estudos a cerca da utilização das células do epitélio do oviduto (BANKS, 2009).


  1. JUSTIFICATIVA

A tuba uterina possui uma população celular constituído de células ciliadas e não ciliadas ou secretoras essas células são induzidas por dois hormônios, sendo eles o estradiol e a progesterona. O estradiol atua na proliferação das células ciliadas, já a progesterona auxilia as células secretoras, estimulando a secreção de diversas substâncias (KIERSZENBAUM, 2008).

Como obtivemos resultados satisfatórios anteriormente na observação da morfologia das células ciliadas e secretoras na presença dos hormônios estradiol e progesterona. A escolha da verificação do apoptose deu se pelo fato de observamos mudanças no formato e na quantidade de cílios nessas células, as células adquirirão formatos achatados, bem como a perda de cílios, assim como Steinhauer (2004) notou essas diferenças.

Portanto o cultivo das células da tuba uterina sob os efeitos do estradiol e da progesterona pode modular o comportamento dessas células, e estas contribuiriam com o desenvolvimento embrionário pré-implantacional.

3. OBJETIVOS

Objetivo geral

Verificar a ocorrência da apoptose em células epiteliais da tuba uterina na presença de hormônios estradiol e progesterona


Objetivos Específicos
Avaliar a imunolocalização da apoptose pela caspase 3 em células da tuba uterina cultivadas com estradiol.

Avaliar a imunolocalização de apoptose pela caspase 3 em células da tuba uterina cultivadas com progesterona.




  1. MATERIAL E MÉTODOS


Delineamento experimental
Foi realizado em duas fases o cultivo da tuba uterina, a primeira consistiu na adição de 10pg/ml de estradiol no de meio TCM – 199 (sigma®), e será avaliada em um período de 6 e 18 horas,baseadas no trabalho de ULBRICH et al., (2003) que utilizou células epiteliais da tuba com adição de estradiol e verificou a expressão de receptores a partir de 6 horas de cultivo in vitro e SARTORI et al., (2012), que analisou animais nas fases de estro e diestro, onde os animais expressaram receptores para estradiol a partir de 18 horas, in vivo.

E a segunda fase consistiu na adição de 10ng/ml de progesterona no meio de TCM – 199 (sigma®), foram analisadas nos horários de 1e 24 horas, tendo como base o trabalho de UBRICH et al., (2003) que utilizou células epiteliais da tuba uterina com adição de progesterona in vitro e verificou a expressão de receptores para progesterona a partir de 1 hora e SANTIAGO et al., (2001), que analisou animais nas fases de diestro, onde os animais expressaram receptores de progesterona a partir de 24 horas, in vivo. Depois do cultivo, e fixadas em formol a 10%, além de um grupo controle TCM – 199 (sigma®) sem adição de estradiol e progesterona. A análise será pela técnica de imunohistoquímica para a localização de caspase-3.



Obtenção e processamento dos cortes das tubas uterinas

As tubas utilizadas foram obtidas a partir de animais sem raça definida, de matadouro local SOCIPE (Sociedade Cooperativa dos Pecuaristas), em Belém – PA. Trazidas em PBS (phosphatebuffered saline – tampão fosfatosalino), contendo 400 μg/mL de estreptomicina (Gibco) e 400 unidades/mL de penicilina (Gibco).

No laboratório de Fertilização In Vitro da Universidade Federal do Pará, as tubas foram colocadas em uma placa de petri de vidro estéril e com o auxílio de um bisturi foram cortado pedaços da tuba em temperatura ambiente. Em seguida os tecidos cortados foram lavados em tubo falcon de 15mL com PBS suplementado com penicilina, gentamicina e estreptomicina, e posteriormente levadas a estufa para o cultivo em meio de TCM – 199 (sigma®) com os respectivos tratamentos e controle.

Os cortes da tuba uterina foram fixados em formol a 10% por 24h, desidratados em concentrações crescentes de álcool, diafanizados em xilol, infiltrados e incluídos em parafina, onde permanecerão até o início dos trabalhos de imunolocalização

Foram realizado corte seriado dos tecidos da tuba, até o final do tecidocom a de espessura 7μm, foram fixadas em lâminas e coradas com Hematoxilina e Eosina (H.E) para avaliar o processamento histológico, da estrutura.
Imunohistoquímica

Para a imunolocalização de caspase-3 as lâminas com corte histológico da tuba uterina foram desparafinizadas em xilol, reidratadas em etanol, lavadas em solução salina tamponada (PBS) e incubadas em peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram imersas em tampão citrato de sódio aquecido a 70°C durante 25 minutos a seguir passaram por uma solução bloqueadora de antígenos inespecíficos por 10 min. As lâminas foram incubadas “overnigth” com anticorpo primário anti-caspase-3 na diluição de 1:200 e por 12 horas. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em PBS tween 0,05% (TWEEN 20, 25564, E.M.S., Hatfield, PA.) e pós-incubadas em anticorpo secundário IgG anti-coelho conjugado com peroxidase (sc-2030) diluído em 1:500 por 2 horas. A reação foi revelada em solução de DAB (3,3’ diaminobenzidina) (750118, Invitrogen, Burlington, ONT, Canada) por 5 minutos. Após, foram lavadas em água destilada, desidratadas e montadas com lamínula e entelan. Para o controle negativo foi utilizado PBS em substituição ao anticorpo primário. Todo este procedimento foi de acordo com as instruções dos fabricantes.

As análises foram realizadas em fotomicroscópio (NIKON Eclipse Ci-E, Nikon Corporation, Tóquio, Japão) acoplado a uma câmera digital (NIKON DS-Ri1, Nikon Corporation, Tóquio, Japão) e em microscópio confocal LSM 740 utilizando o sistema ZEN de captura de imagem.
A reação imunohistoquímica será avaliada sob dois aspectos, a intensidade e a proporção de células coradas. Apenas será considerada a coloração nuclear nas células. O método de avaliação utilizado neste experimento será o proposto por DETRE et al., (1995), denominado “quickscore”. A proporção de células coradas positivamente no corte será definida através da análise de dez campos, em aumento de 400x e dividida em escores de 1 a 6 (1 = 0- 4%; 2 = 5-19%; 3 = 20-39%; 4 = 40-59%; 5 = 60-79%; 6 = 80-100%). A intensidade média, correspondendo à presença de coloração negativa (0), fraca (1), intermediária (2) e forte (3) foi avaliada e será aplicado um índice multiplicativo (proporção de células coradas x intensidade de coloração).


  1. RESULTADOS

Até o presente momento as tubas uterinas já foram coletadas e cultivadas, estamos padronizando a técnica de imunohistoquímica.

  1. PUBLICAÇÕES

7. ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES

Padronizar a técnica de imunohistoquimica.

Analisar o material processado como proposto no plano.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AVILÉS, M .COY,P. RIZOS, D. The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events. Animal Frontiers. Jan. Vol. 5, No. 1 . 2015.

BANKS, A. et al. Associations Between Heat Shock Protein 70 Genetic Polymorphisms and Calving Rates of Brahman-Influenced Cows. Animal Science, p. 10, 2009.

BUHI, W.C., ALVAREZ, I.M., KOUBA, A.J.,Secreted proteins of the oviduct. Cells Tissues Organs. 166, 165–179, 2000.

BUHI WC.Characterization and biological roles of oviductspecific, oestrogen-dependent glycoprotein.Reproduction. 123:355– 62, 2002

DENHARDT DT, GUO X. Osteopontin: a protein with diverse functions. Faseb J. 7:1475–1483, 1993

HAYES R., AHMEDA A., EDGE T., ZHANGA H., Core–shell particles: Preparation, fundamentals and applications in high performance liquid chromatography.Elsevier9 May 2014

JARDIM, I. C. F. S., GUIMARÃES, L. F. L., COLLINS, C. H. Cromatografia líquida de alta eficiência. In: Fundamentos de cromatografia. Campinas: Editora da UNICAMP,453p. 2006

JONES B. C.,LOK, I. H.,CHEUNG, C. K. B.SC., CHIU, T. T. Y. CHEUNG, L. P. ANDHAINES,C.Estradiolregulation of oviductin/oviductspecific glycoprotein messenger ribonucleic acid expression in human oviduct mucosal cells in vitro. Elsevier vol. 81, suppl. 1, march 2004

KILLIAN, G.J., Evidence for the role of oviduct secretions in sperm function, fertilization and embryo development.Animal Reproduction Science. V. 82, p. 141–153. 2004.

KIERSZENBAUM, A.L., Histologia e Biologia Celular: uma introdução á patologia. Elsevier. 2 ed. 619 – 636. 2008

MICHAEL P. MULLEN, FULLER W. BAZER, GUOYAO WU, MERVYN H. PARR, ALEXANDER C. O. EVANS, MARK A. CROWE, AND MICHAEL G. DISKIN. Effects of systemic progesterone during the early luteal phase on the availabilities of amino acids and glucose in the bovine uterine lumen.Journalcompilation. Reproduction, FertilityandDevelopment, 26, 282–292, 2014.

STEINHAUER N., BOOS A. AND GU¨ NZEL-APEL A-R. Morphological Changes and Proliferative Activity in the Oviductal Epithelium during Hormonally Defined Stages of the Oestrous Cycle in the Bitch.Reprod Dom Anim39, 110–119, 2004.

VASQUEZ R. L., HAMDI M,.MAILLO V., LLOREDA V., COY P., ADAN G. A., ALAREZ B. P. AND RIZOS D.Effect of bovine oviductal fluid on development and quality of bovine embryos produced in vitro. Journal compilation.14 October 2015



DIFICULDADES

PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso.

DATA :______/_________/________

_________________________________________

ASSINATURA DO ORIENTADOR

____________________________________________

ASSINATURA DO ALUNO

INFORMAÇÕES ADICIONAIS:Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição.

FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO:

  1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?



  1. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho?



  1. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?



  1. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?



  1. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório



  1. Parecer Final:

Aprovado ( )

Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações)

Reprovado ( )


  1. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________

Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.

Data: _____/____/_____.



________________________________________________

Assinatura do(a) Avaliador(a)






©aneste.org 2017
enviar mensagem

    Página principal