Protocolo para pcr



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Encontro09.08.2019
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BIOLOGIA MOLECULAR - PRÁTICA 3
PROTOCOLO para Eletroforese de DNA em gel de Agarose


  1. O gel de agarose foi feito previamente adicionando-se 0,5 g de agarose em 50 mL de tampão TAE 1x, fundindo-se o gel em microondas, adicionando-se 10 g/ml de brometo de etídio e despejando-o na cuba apropriada para solidificação.

  2. Após solidificação, transferir o gel com o suporte para a cuba de eletroforese. Adicionar quantidade suficiente do tampão de corrida TAE para cobrir o gel a uma altura de aproximadamente 1 mm.

  3. Conectar os eletrodos à fonte, certificando se as canaletas do gel estão próximas do catodo (eletrodo preto).

  4. Preparar as amostras de DNA misturando-as ao tampão de aplicação da amostra segundo esquema abaixo(*). Para facilitar a aplicação, o óleo do PCR foi retirado e o tampão adicionado.

  5. Utilizando uma micropipeta aplicar lentamente 10 µl das misturas das amostras nas canaletas do gel. Anotar no espaço abaixo a sequência das amostras aplicadas no gel.

  6. Aplicar uma voltagem de 100V, prosseguindo a corrida até que os corante azul de bromofenol (e xileno cianol qdo houver) tenham migrado uma distância apropriada no gel.

  7. Desligar a corrente elétrica e remover os cabos dos eletrodos.

  8. Examinar o gel por luz ultravioleta, pois o Etídio intercalado em DNA fluoresce no vermelho enquanto que o não intercalado no amarelo claro – assim, o DNA aparece alaranjado. Documentar o gel. Qdo foto é realizada, usa-se um filtro que não permite que a UV seja transmitida, mas somente a luz alaranjada.

OBS: Radiação ultravioleta é danosa, particularmente para os olhos. Use óculos, máscaras de proteção ou barreiras adequados.

Solução TAE 1x: Tris base 40 mM pH 7,2, ácido acético 20 mM, 1 mM EDTA

Tampão da amostra 6 x: TAE 6x, azul de bromofenol 0,25% (xileno cianol 0,25%), Ficol 400 15%

Padrão de tamanho molecular 1 Kb ladder ou lambda Hind III em tampão de amostra - 10 l

As quantidades de amostras a serem analisadas são:

- reação de PCR: 10 l + 2 l de tampão de amostra 6x

- reação de digestão: 20 l + 4 l de tampão de amostra 6x



Analisar também controles negativos de digestão (sem enzimas) e PCR (sem DNA).


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