Procedimentos utilizados em experimentos com ratos



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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

Centro de Ciências Biológicas


Departamento de fisiologia

CURSO DE MEDICINA


PCI DE SISTEMA ENDÓCRINO E REPRODUTOR

AULA PRÁTICA



Procedimentos utilizados em experimentos com ratos



1. Manuseio do Animal:

  • Retire o animal da caixa, suspendendo-o pela cauda e o coloque sobre a mesa ou bancada, sem soltá-lo;

  • Não deixe o animal suspenso no ar pois ele pode fazer movimentos bruscos que podem ocasionar o seccionamento da cauda;

  • Introduza o animal no cone, o qual deve ter um tamanho adequado para o tamanho do animal;

  • Segure o cone e o animal com firmeza, mas sempre com o cuidado de não machucar o animal; você pode usar uma “toalha velha” ou uma luva de gato para melhor proteção, se necessário;

  • Execute o procedimento desejado (injeção, coleta de fluidos) e libere o animal em seguida, devolvendo-o para a caixa.


2. Injeção Intraperitoneal (i.p.) (Shibutani, 2000):

  • Segure o animal com o ventre para cima e com a cabeça ligeiramente inclinada para baixo, para permitir que as vísceras se desloquem em direção ao diafragma, e reduzindo-se o risco de perfuração dos intestinos e ceco;

  • Administre a injeção no quadrante inferior esquerdo do abdomen;

  • Introduza a agulha fazendo um ângulo de 20-45 com a parede abdominal; caso a agulha seja muito comprida intoduza-a apenas parcialmente;

  • Antes de injetar o medicamento, aspire o conteúdo para verificar se você não atingiu a bexiga, intestinos, ou algum vaso.

  • Execute a injeção do medicamento;

  • Volume máximo por injeção: 5-10 ml (agulha G24)



3. Injeção Subcutânea (s.c.) (Nebendahl, 2000):

  • Locais preferenciais: áreas dorsolaterais do pescoço e ombros, região dorsal, região da coxa;

  • Segure uma dobra de pele levantando-a com os dedos polegar e indicador.

  • Introduza a agulha na base da dobra paralelamente à superfície corporal do animal;

  • Se a agulha estiver na posição certa, você será capaz de perceber a sua ponta levantando-a sob a pele.

  • Execute a injeção do medicamento;

  • Volume máximo por injeção: 1-5 ml (agulha G24)



4. Doses de Medicamentos e Anestésicos (Zimmermann et al., 2000; Shibutani, 2000)

  • Hidrocloreto de Cetamina (anestésico): 11,5 mg/100g peso i.p.

  • Xilazina (relaxante muscular): 0,1 mg/100g peso i.p.

  • Diazepam (sedativo): 2,5-5 mg/kg i.p.

  • Amoxacilina (antibiótico): 150 mg/kg s.c., 10 min antes da cirurgia

  • Ampicilina (antibiótico): 150 mg/kg s.c., 10 min antes da cirurgia


5. Doses de Drogas e Hormônios (Zarrow et al., 1964):

  • Aloxana: 50-100 mg/kg i.v. ou 150-200 mg/kg s.c., dose única

  • Benzoato de estradiol: 1 g/100g peso s.c. por 5 dias

  • Propionato de testosterona: 300 g/100g peso s.c. por 5 dias

  • Propiltiouracil: solução aquosa a 0,1% ad libitum por 2 semanas

  • L-tiroxina: 0,5-3,0 g/100g peso i.p. por 7 dias


6. Coleta de Sangue (Weiss et al., 2000):

  • Informações gerais:

    • Volume total de sangue do rato: 58-70 ml/kg (cerca de 6,4% do peso do animal). Um animal de 200g teria aproximadamente 19 ml de volume total de sangue;

    • Volume máximo de coleta:

      • Diário: 0,2 ml/300g peso

      • Semanal: 0,9 ml/300g peso

      • Terminal: n.a.




  • Técnica de amputação da cauda: para pequeno volume (<0,5ml)

    • Seccione a ponta da cauda, a cerca de 5 mm da extremidade

    • Esprema a cauda na direção base-extremidade

    • Colete a gota de sangue




  • Técnica da punção cardíaca: até 1-2 ml de sangue

    • Anestesie o animal

    • Posicione o animal em decúbito lateral direito ou decúbito dorsal

    • Localize o coração posicionando o dedo indicador sobre o tórax, entre a 4a e a 6a costela, e perceba os batimentos cardíacos

    • Caso a coleta não seja terminal, faça a depilação e antisepsia do local

    • Introduza a agulha perpendicularmente à parede torácica

    • Após ter penetrado no coração, aplique sucção leve para aspirar o sangue

    • A coleta deve ser lenta, não mais do que 2 ml em 1 minuto

    • Se, ao aplicar a sucção você sentir resistência e não vier sangue, a ponta da agulha não está no local certo. Neste caso, mova a agulha para trás e tente reposicioná-la.

    • NÃO ESQUECER DE USAR SERINGA E AGULHA PREVIAMENTE HEPARINIZADAS!!!



7. Coleta da Secreção Vaginal:

  • Segure o animal a propriadamente

  • Coloque uma gota de água ou soro fisiológico na vagina da rata com um conta-gotas.

  • Introduza cerca de 0,5 cm da ponta do conta-gotas na vagina da rata. Introduza o soro e aspire; repita isso 3-4 vezes e depois colete o fluido.

  • Estenda o material colhido sobre lâmina histológica limpa e desengordurada, previamente preparada. Identifique a lâmina.

  • Observe sob o microscópio a fresco e identifique a fase do ciclo estral

  • Identifique a fase do ciclo e faça anotações sobre o que observa; use desenhos se necessário



8. Tireoidectomia (adaptado do Manual do Curso de Verão de Fisiologia da FMRB-USP)

  • Após a anestesia posicione o animal sobre na prancha de operação em decúbito dorsal

  • Administre antibiótico ao animal 10 minutos antes de iniciar a cirurgia

  • Durante esse período deixe o material cirúrgico no Germkill, e um pouco antes da cirurgia lave-o em água corrente.

Cirurgia:



  • Faça a depilação da área onde será feita a incisão na região do pescoço (ver figura)

  • Faça a antissepsia da área com álcool iodado ou etanol a 70%

  • Faça uma incisão na linha mediana do pescoço como mostra a figura;




  • Afaste pele, fáscia e glândulas submaxilares para permitir a exposição dos músculos esternomastóideo e esternoióideo;

  • Afaste o tecido muscular ao longo da linha mediana para expor a traquéia e glândula tireóide. Use os clips para auxiliar no afastamento;





  • Sob o microscópio de dissecção, visualize a glândula e a malha vascular e neural associada. Use pequenas bolas de algodão para auxiliar na hemostasia e para o afastamento de tecidos ao redor da glândula;

  • Use as pinças de relojoeiro para dissecar cuidadosamente a borda lateral de um dos lobos da glândula. Depois levante essa borda e com o auxílio de uma tesoura, corte o tecido entre a glândula e a traquéia. Repita o mesmo procedimento para o outro lobo para tentar remover todo o tecido glandular incluindo o ístmo;

  • Após a remoção da glândula, inspecione o tecido e a região da traquéia para verificar se a remoção foi completa;

  • Permita o retorno do tecido muscular para a sua posição normal, e suture a pele sobrejacente.


9. Ooforectomia (ovariectomia) (adaptado do Manual do Curso de Verão de Fisiologia da FMRB-USP):

Após a anestesia posicione o animal na prancha de operação em decúbito ventral.

Cirurgia:


  • Faça a depilação da área onde será feita a incisão (no dorso, região a meio caminho entre a última costela e o joelho, (ver figura).




  • Limpe a área com álcool iodado e faça uma incisão mediana na pele de cerca de 3 cm.

  • Para expor o tecido muscular, divulsione com uma tesoura ponta romba indo de medial para lateral.

  • Uma segunda abertura, oblíqua, é feita no músculo, à meia distância entre a última costela e o joelho, lateralmente à linha mediana, e então chega-se á cavidade peritoneal.



  • Se a incisão estiver no local correto, o ovário deverá estar imediatamente abaixo, embebido na massa de tecido adiposo.

  • Ovariectomia: retire o tecido adiposo para fora da cavidade e separe o ovário fazendo uma ligadura com o fio de sutura (ver figura).

  • Depois seccione distalmente à ligadura e coloque o tecido restante para dentro da cavidade.

  • Suture o tecido muscular com um ou dois pontos com fio absorvível.

  • Repita o procedimento no outro lado caso deseje castração bilateral.

  • Suture a pele com fio de seda, nylon ou algodão.




10. Orquidectomia (adaptado do Manual do Curso de Verão de Fisiologia da FMRB-USP):

Após a anestesia posicione o animal na prancha de operação em decúbito dorsal.

Cirurgia:


  • Certifique-se de que ambos os testículos estão na bolsa escrotal. Caso não estejam, precione o abdome do animal no sentido crânio-caudal.



  • Visualize a rafe escrotal e nela faça uma pequena incisão.

  • Divulsione até a túnica vaginalis em torno do testículo.

  • Faça um corte na túnica.

  • Exponha o testículo fazendo uma leve pressão sobre ele

  • Visualize o cordão espermático para posterior ligadura

  • Seccione distalmente à ligadura

  • Se desejar castração bilateral repita o procedimento no testículo contralateral.

  • Suture a pele.


Bibliografia:
Nebendahl, K. (2000). Routes of Administration In The Laboratory Rat (ed. Krinke, G.J.), pp. 463-484. Academic Press: London.
Shibutani, M. (2000). Anesthesia, Artificial Ventilation and Perfusion Fixation In The Laboratory Rat (ed. Krinke, G.J.), pp. 511-522. Academic Press: London.
Zarrow, M.X., Yochim, J.M., McCarthy J.L., Sanborn, R.C. (1964). Experimental Endocrinology. Academic Press: New York.
Zimmermann, F, Weiss, J., Reifenberg, K (2000). Breeding and Assisted Reproduction Techniques In The Laboratory Rat (ed. Krinke, G.J.), pp. 177-198. Academic Press: London.
Weiss, J., Taylor, G.R., Zimmermann F., Nebendahl, K. (2000). Collection do Body Fluids, In The Laboratory Rat (ed. Krinke, G.J.), pp. 485-510. Academic Press: London.
Sugestões e comentários
Professora Dra. Elizabeth Sumi Yamada: esyamada@ufpa.com

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