Métodos e materiais 1 Cultura de células



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________________________________________________________________ Capítulo 2

CAPÍTULO 2



MÉTODOS E MATERIAIS


2.1 Cultura de células
2.1.1 Culturas primárias de células da retina de embrião de pinto
As culturas primárias de neurónios da retina de pinto White Leghorn foram preparadas a partir de embriões com 8 dias de desenvolvimento, de acordo com o método descrito por Mello (1984) e modificado por Duarte e colaboradores (Duarte et al. 1992).
Os ovos foram limpos com álcool etílico e abertos em condições estéreis. Os embriões foram retirados e os olhos recolhidos para uma caixa de Petri com solução salina de Hank sem cálcio e sem magnésio (NaCl 132 mM, KCl 5,4 mM, KH2PO4 0,45 mM, Na2HPO4 0,34 mM, glicose 5mM, pH 7,4). O tecido conjuntivo que envolve o olho foi eliminado e em seguida a retina foi separada dos restantes tecidos oculares. As retinas foram posteriormente incubadas durante 15 minutos, a 37°C, em solução salina de Hank, sem cálcio e sem magnésio, contendo tripsina 0,1 % (p/v). Após centrifugação a 140 x g, durante um minuto (Sorval RT 6000B), o tecido digerido (sedimento) foi colocado em meio basal de Eagle (BME, Basal Medium Eagle) enriquecido com soro fetal de bovino (FCS, Fetal Calf Serum) 5 % (v/v), e as células da retina foram de seguida dissociadas mecanicamente, pipetando o tecido 10 vezes com uma pipeta de 5 ml. A presença de FCS permite terminar completamente a digestão enzimática. As células isoladas foram cultivadas em BME tamponizado com HEPES 25 mM e NaHCO3 10 mM, pH 7,4, enriquecido com FCS 5 % (v/v), e na presença de gentamicina 60 g/ml. As culturas foram mantidas neste meio durante 5 dias, a 37°C, numa incubadora com atmosfera humidificada, constituída por 95 % de ar e 5 % de CO2. O FCS usado nas culturas celulares foi previamente incubado a 56°C, essencialmente para inibir a actividade de proteínas do complemento.
Estudos de imunocitoquímica com anticorpos contra colina-acetiltransferase (ChAT) e contra o ácido -aminobutírico (GABA) mostraram que as culturas de neurónios da retina de pinto, preparadas nestas condições experimentais, são constituídas maioritariamente (81,2 %) por células amácrinas colinérgicas, algumas das quais são também GABAérgicas (38,5 %) (Santos et al., 1998).
Para os estudos de avaliação de excitotoxicidade as células foram cultivadas em monocamada, com uma densidade de 0,6 x 106 células/cm2, em placas de cultura com 12 compartimentos (para os ensaios do MTT), ou em lamelas de vidro de 16 mm de diâmetro (para estudos de microscopia de fluorescência), revestidas com poli-D-lisina de peso molecular superior a 300000 (0,1 mg/ml). Para o estudo da actividade de factores de transcrição, ou para o estudo da activação da cinase de proteínas activada por agentes mitogénicos (MAPK-ERK), as células foram cultivadas em monocamada, com uma densidade de 0,94 x 106 células/cm2, em placas de Petri de 100 mm de diâmetro, revestidas com poli-D-lisina. As culturas de neurónios da retina foram usadas ao quinto dia in vitro.

2.1.2 Culturas de células 293 de rim de embrião humano (Human Embryonic Kidney - HEK 293)
As células 293 de rim de embrião humano usadas neste trabalho expressam constitutivamente a subunidade GluR4flip dos receptores do glutamato (HEK-GluR4) (Iizuka et al., 2000; Nishimura et al., 2000). O clone de GluR4, obtido de células HEK 293 transformadas com um vector de expressão onde foi inserido cDNA humano da subunidade GluR4, foi seleccionado com geneticina (G-418) (Iizuka et al., 2000; Nishimura et al., 2000). Esta linha celular foi cedida pelo Dr. E. L. Barsoumian, Nippon Boehringer Ingelheim Co.
As células foram cultivadas em monocamada, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) enriquecido com FCS 10 % (v/v) e contendo geneticina (G-418) 0,4 g/L. As culturas foram mantidas a 37°C, sob uma atmosfera humidificada com 5 % de CO2 e 95 % de ar, e diluídas de 1:4 de 3 em 3 dias. As células, cultivadas sobre superfícies revestidas com poli-D-lisina, foram usadas em subconfluência, ao segundo dia in vitro.
2.2 Estimulação dos receptores do glutamato
2.2.1 Estimulação dos receptores do glutamato em culturas primárias de células da retina de pinto
As culturas primárias de neurónios da retina de pinto foram estimuladas com agonistas dos receptores do glutamato ao quinto dia in vitro. Após lavagem das células da retina com solução salina (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, glicose 6 mM, Ca2+ 1 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) estas foram estimuladas com os agonistas dos receptores do glutamato, glutamato (100 M) ou cainato (100 M), em solução salina (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, glicose 6 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4), com Ca2+ 1 mM, sem Mg2+. A estimulação excitotóxica foi efectuada durante 1 h, a 37°C, com excepção dos ensaios assinalados no texto e nas legendas das figuras. No fim do período de estimulação o meio contendo o agonista dos receptores do glutamato foi removido, e as células foram lavadas com solução salina e colocadas em meio de cultura sem soro, na câmara de incubação, durante o tempo pretendido.
As culturas de células da retina foram pré-incubadas durante 5 minutos com os antagonistas dos receptores do glutamato, (+)-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzeno[a,b]ciclohepteno-5,10-imina maleato (MK-801), 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX), e o isómero activo da 1-(4-aminofenil)-3-metilcarbamil-4-metil-7,8-metilenodioxi-3,4-dihidro-5H-2,3-benzodiazepina (LY 303070), sempre que estes compostos estiveram presentes durante a estimulação dos receptores do glutamato. O mesmo procedimento foi adoptado quando se utilizou a ciclotiazida (CTZ), um inibidor da dessensibilização dos receptores AMPA.
Para estudar o efeito modulador do Ca2+ na activação do factor de transcrição AP-1, as culturas de células da retina foram expostas aos agonistas dos receptores do glutamato em solução salina com Ca2+ 1 mM ou, alternativamente, numa solução salina (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, glicose 6 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 0,5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) cuja concentração de cálcio basal foi de 50 nM.
Nos estudos de activação da MAPK-ERK a estimulação com os agonistas dos receptores do glutamato foi efectuada durante 2 ou 5 minutos, e no final do período de estimulação prepararam-se extractos totais das células da retina. Quando os inibidores das MAPKs SB 203580, PD 98059 e U0126 foram usados, as células da retina foram pré-incubadas durante 1 h com estes compostos.

2.2.2 Estimulação dos receptores do glutamato em culturas de células HEK-GluR4
Ao segundo dia in vitro as células HEK-GluR4 foram estimuladas com glutamato, a 37°C, durante 1 ou 24 horas. A exposição ao glutamato durante 1 hora foi efectuada em solução salina (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, glicose 6 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4), na presença de Ca2+ 1 mM ou 2,5 mM e sem Mg2+. Após o estímulo, o meio contendo o agonista dos receptores do glutamato foi removido, as células foram lavadas com solução salina e colocadas em meio de cultura sem soro, na câmara de incubação, durante o tempo pretendido. Sempre que os estímulos foram efectuados na presença de Ca2+ 2,5 mM, o meio de cultura sem soro foi enriquecido de modo a ter essa concentração final de cálcio. A estimulação com glutamato durante 24 horas foi efectuada em meio de cultura sem soro, e de seguida foi realizado o ensaio de viabilidade celular.
As células HEK-GluR4 foram pré-incubadas durante 5 minutos com a CTZ, e com o CNQX, um antagonista dos receptores AMPA, sempre que estes compostos estiveram presentes durante a estimulação dos receptores do glutamato.
Para determinar a contribuição do Ca2+ na resposta excitotóxica, ou na activação do factor de transcrição AP-1, em células HEK-GluR4, os estímulos excitotóxicos foram efectuados em solução salina (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, glicose 6 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) na presença de Ca2+ 1 mM ou 2,5 mM ou, alternativamente, em solução salina sem Ca2+ e com MgCl2 1 mM.


2.3 Estudos de viabilidade celular
2.3.1 Ensaio do MTT
O ensaio com o brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) é um ensaio colorimétrico que reflecte a viabilidade celular. Este ensaio baseia-se na capacidade de células metabolicamente activas reduzirem no meio intracelular o sal solúvel de tetrazólio dando origem a cristais de formazan, que é um produto de cor azul escura insolúvel em água, (Mosmann, 1983). Apesar de inicialmente se ter atribuído a redução do MTT a desidrogenases mitocondriais (Mosmann, 1983), foi demonstrado que a redução do MTT em células intactas ocorre maioritariamente fora da mitocondria, por desidrogenases não mitocondriais, e envolve provavelmente os cofactores nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) e nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) (Berridge & Tan, 1993; Liu et al, 1997). Foi proposto que o MTT entra nas células por um processo de endocitose e que o produto da sua redução, o formazan, se acumula em endossomas/lisossomas, sendo depois secretado por exocitose (Liu et al., 1997). Este ensaio é válido para a quantificação da viabilidade ou proliferação celular pois a endocitose é um processo que só ocorre em células viáveis (Liu et al., 1997).
Vinte a vinte e quatro horas após o início do estímulo excitotóxico, o meio de cultura das células foi removido e as células foram incubadas com MTT em solução salina (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1 mM, glicose 6 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4). As células da retina foram incubadas durante 3h, a 37°C, com MTT 0,75 mg/ml, enquanto que as células HEK-GluR4 foram incubadas durante 30 minutos, a 37°C, com MTT 0,5 mg/ml. Após o período de incubação a solução salina de MTT foi removida e os cristais insolúveis de formazan foram dissolvidos numa solução de HCl 0,04 M em isopropanol. A absorvência foi determinada a um comprimento de onda de 570 nm, usando como referência o comprimento de onda de 620 nm, num leitor automático de placas de cultura Spectra (SLT). A viabilidade celular foi expressa em percentagem relativamente à absorvência determinada nas células da situação controlo. Os ensaios foram feitos em triplicado.

2.3.2 Determinação de apoptose versus necrose com base na análise da morfologia nuclear
A morfologia nuclear das células da retina de pinto foi analisada por microscopia de fluorescência, em preparações de células vivas, cultivadas sobre lamelas de vidro com uma densidade de 0,6x106 células/cm2. Foram usados como marcadores de DNA o iodeto de propídio (PI, Propidium Iodide), cuja fluorescência é vermelha, e o SYTO-13, cuja fluorescênca é verde.
Este ensaio, que nos permite identificar células viáveis e células com morfologia nuclear do tipo apoptótico ou do tipo necrótico, baseia-se na permeabilidade selectiva da membrana plasmática aos marcadores de DNA utilizados e nas alterações da morfologia nuclear que acompanham o processo apoptótico (Ankarcrona et al., 1995; Bonfoco et al., 1997). A membrana plasmática não é permeável ao iodeto de propídio, que entra na célula apenas quando a membrana celular apresenta rupturas, enquanto que o SYTO-13 permeia a membrana plasmática, penetrando em células com a membrana celular intacta. Assim, utilizando simultaneamente estes dois marcadores de DNA foram visualizados: i) os neurónios viáveis, com o núcleo corado de verde, de uma forma difusa, e com dimensões idênticas aos núcleos de células controlo; ii) os neurónios necróticos, com o núcleo corado de vermelho, sem grandes massas de cromatina condensada, e de dimensões idênticas ou maiores que as dos núcleos de células controlo; iii) os neurónios com morfologia do tipo apoptótico com o núcleo corado de verde, de dimensões inferiores aos núcleos de células viáveis, e com cromatina condensada e possivelmente fragmentada. Com esta metodologia é possível também observar neurónios com morfologia correspondente a um processo de necrose secundária, aparecendo neste caso os núcleos corados de vermelho, e com a cromatina condensada e possivelmente fragmentada. Os neurónios que apareceram com uma morfologia de necrose secundária foram considerados como neurónios apoptóticos, pois o processo de necrose secundária reflecte uma insuficiência na remoção das células apoptóticas em sistemas in vitro, nos quais processos secundários à apoptose podem levar à degradação da membrana celular (Ankarcrona et al., 1995; Bonfoco et al., 1997).
Cinco horas após o estímulo excitotóxico as células da retina de pinto foram lavadas e incubadas, durante 5 minutos, com SYTO-13 0,5 M e iodeto de propídio 2 g/ml, em meio salino (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1 mM, glicose 6 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4). Em seguida as células foram observadas num microscópio de fluorescência (Nikon Diaphot TMD) com um filtro de triplo comprimento de onda (Omega XF63). Os ensaios foram efectuados em duplicado, e a quantificação foi efectuada contando um mínimo de 300 células por lamela.

2.3.3 Avaliação do processo de morte celular com Hoescht 33342 por análise da morfologia nuclear
A morfologia nuclear das células HEK-GluR4 foi analisada por microscopia de fluorescência, em preparações de culturas subconfluentes, cultivadas sobre lamelas de vidro. Foi usado como marcador de DNA o corante Hoechst 33342, cuja fluorescência é azul.
Este ensaio baseia-se na análise das alterações da morfologia nuclear características do processo de morte por apoptose. A membrana plasmática das células fixadas é permeável ao Hoechst 33342 e, por isso, todos os núcleos coram de azul. No entanto, enquanto que os núcleos das células viáveis apresentam uma fluorescência azul difusa, os núcleos das células apoptóticas apresentam maior intensidade de fluorescência, possuindo a cromatina condensada e possivelmente fragmentada, e têm menores dimensões do que os núcleos de células viáveis (Bonfoco et al., 1997; Yan & Paul, 1997).
Treze horas após o estímulo excitotóxico, as células HEK 293-GluR4 foram lavadas com uma solução tampão de fosfato (PBS, Phosfate Buffer Saline: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH 7,4) e fixadas com paraformaldeído 4 % (p/v) em PBS, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. Após a fixação, as células foram lavadas e incubadas com Hoechst 33342 (15 g/ml) em PBS, durante 10 minutos. Depois de uma nova série de lavagens as lamelas foram montadas sobre lâminas, usando o meio de montagem “Dako fluorescent mounting medium”, que reduz o fotodecaímento da fluorescência. As células foram visualizadas num microscópio de fluorescência Zeiss Axioskop equipado com filtros G365, FT 395, LP 420 (Zeiss, Germany). Foram efectuados duplicados de cada situação experimental.

2.4 Análise da activação dos factores de transcrição com o ensaio da alteração da mobilidade electroforética (EMSA)
A análise da activação dos factores de transcrição pelo ensaio da alteração da mobilidade electroforética (EMSA, Electrophoretic Mobility Shift Assay) baseia-se no estudo da ligação dos factores de transcrição ao DNA. Extractos nucleares são incubados com um oligonucleótido de cadeia dupla, que contém a região consenso da ligação para o factor de transcrição em estudo, formando-se complexos (oligonucleótido - factor de transcrição), no caso de existir factor de transcrição nos extractos nucleares. Estes complexos são depois separados do oligonucleótido livre por electroforese, em condições nativas, em gel de poliacrilamida. A visualização das bandas correspondentes ao oligonucleótido livre e aos complexos (oligonucleótido - factor de transcrição) é feita por autoradiografia, uma vez que o oligonucleótido usado é previamente marcado com [-32P]ATP.

2.4.1 Preparação de extractos nucleares
Os extractos nucleares foram preparados imediatamente após a estimulação dos receptores do glutamato ou no fim de um período de pós-estimulação, durante o qual as culturas celulares foram mantidas a 37°C, em meio de cultura sem soro.
As células foram lavadas duas vezes com PBS a 4°C e solubilizadas no tampão 1 (HEPES 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, Triton X-100 0,1 %, EGTA 1 mM, pH 7,5) ao qual foi adicionado, imediatamente antes de usar, ditiotreitol (DTT) 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride) 1 mM, trans-epoxisuccinil-L-leucilamido-4-guanidinobutano (E 64) 10 M, benzamidina 20 g/ml, e pepstatina A 25 g/ml. Alternativamente, ao tampão 1 foi adicionado DTT 1 mM e um conjunto de inibidores de proteases (Complete Mini). Os extractos em tampão 1 foram recolhidos para tubos de 1,5 ml e colocados a 4°C, durante 30-40 minutos. Após esta incubação os núcleos foram sedimentados por centrifugação a 2400 x g, durante 10 minutos, a 4°C (Eppendorf Centrifuge 5402), e ressuspensos no tampão 2 (HEPES 25 mM, NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM, EGTA 1 mM, glicerol 20 %, pH 7,4) ao qual foi adicionado, imediatamente antes de usar, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, E 64 10 M, benzamidina 20 g/ml, e pepstatina A 25 g/ml. Alternativamente, foi também usado a solução concentrada de inibidores de proteases “Complete Mini”. Depois de 60 minutos de incubação a 4°C no tampão 2, os núcleos foram centrifugados a 12000 x g, durante 20 minutos, a 4°C. Os sobrenadantes (extractos nucleares) foram recolhidos e armazenados a -70°C. A concentração em proteína foi determinada usando o método do ácido bicinconínico (Smith et al., 1985), com um conjunto de reagentes da Pierce.

2.4.2 Marcação de oligonucleótidos com [-32P]ATP
Oligonucleótidos de cadeia dupla (40 ng) contendo a região consenso da ligação para os factores de transcrição AP-1, NF-B e Oct-1 (Tabela I), foram marcados individualmente com 5 l de [-32P]ATP (10 Ci/l), usando 2 l da cinase de polinucleótidos T4 (20-50 unidades/l), num tampão contendo Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, espermidina-HCl 0,1 mM, e EDTA 0,1 mM. A reacção de marcação decorreu durante 60-90 minutos a 37°C. No final eliminou-se o [-32P]ATP que não foi adicionado ao oligonucleótido por centrifugação numa coluna Sephadex G-50 a 710 x g, durante 2 minutos (centrifuga Jouan M14.11). O eluato, contendo o oligonucleótido marcado, foi conservado a -20°C. Foi determinada a radioactividade de 1 l de eluato em 5 ml de liquído de cintilação Universol, usando um contador de cintilações Packard 2500 TR. Imediatamente antes da purificação do oligonucleótido, a coluna de Sephadex G-50 foi centrifugada a 490 x g durante 1 minuto.
Tabela 2.1. Sequência dos oligonucleótidos de cadeia dupla, contendo a região consenso da ligação para os factores de transcrição AP-1, NF-B e Oct-1, usados no EMSA.


Factor de transcrição

Oligonucleótidos usados no EMSA

AP-1

5’–CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3’;

NF-B

5’–AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’;

Oct-1

5’–TGTCGAATGCAAATCACTAGAA-3’

2.4.3 Ligação dos factores de transcrição ao DNA, electroforese em gel de poliacrilamida e autorradiografia
Oito ou vinte g de proteína dos extractos nucleares foram incubados respectivamente com o oligonucleótido para o AP-1 ou o NF-B, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Foi usada uma quantidade de oligonucleótido radioactivo com 150000 cpm (cpm, cintilações por minuto). A ligação dos factores de transcrição aos oligonucleótidos foi feita num tampão de reacção contendo HEPES 20 mM, pH 7,9, KCl 50 mM, MgCl2 1 mM, DTT 0,5 mM, Ficoll 4 % (p/v), poli(dI-dC).poli(dI-dC) 2 g, e albumina sérica bovina (BSA, Bovine Serum Albumin) 20 g.
Os complexos (oligonucleótido - factor de transcrição) foram separados do oligonucleótido livre por electroforese, em condições nativas, em gel de poliacrilamida a 4 %. Na electroforese foi usado um tampão de ácido bórico 44,5 mM, Tris base 44,5 mM, e EDTA 1 mM pH 8,0. A electroforese foi efectuada a 150 V durante aproximadamente 2 horas. O gel foi equilibrado com o tampão (“pré-run”), a 150 V, durante 1 hora, antes da aplicação das amostras.
No final da electroforese o gel foi seco a 80°C, durante 1 h, num secador de geis BioRad Model 583 Gel Dryer. Os complexos (oligonucleótido – factor de transcrição) e o oligonucleótido livre foram visualizados por autorradiografia, usando-se para o efeito um filme sensível ao decaimento do 32P (Hyperfilm ECL), que foi exposto ao gel durante 15-24 h. As imagens das autorradiografias foram digitalizadas e quantificadas usando o programa ImageQuant (Molecular Dynamics).

Para identificar as proteínas que constituem os factores de transcrição AP-1 e NF-B, para cada proteína investigada foram efectuados ensaios da alteração da mobilidade electroforética nos quais se utilizaram extractos nucleares previamente incubados com 1,5-3 g de anticorpo dirigido contra a proteína em estudo. A incubação das proteínas nucleares com o anticorpo foi feita durante 2 h, a 4°C, sob agitação suave, e em seguida procedeu-se à incubação com o oligonucleótido marcado com [-32P]ATP, segundo o protocolo acima descrito. Este ensaio permite separar por electroforese o oligonucleótido livre dos complexos (oligonucleótido – factor de transcrição) e ainda dos complexos (anticorpo – factor de transcrição – oligonucleótido). Os últimos complexos formam-se no caso da proteína contra a qual o anticorpo foi produzido estar presente no dímero do factor de transcrição. A mobilidade dos complexos que contêm o anticorpo é menor do que a dos complexos (oligonucleótido – factor de transcrição), aparecendo portanto uma banda adicional, localizada mais perto do ponto de aplicação. Este ensaio é designado por ensaio de “supershift” (supershift assay).


Na análise da ligação dos factores de transcrição ao DNA a especificidade da ligação oligonucleótido – factor de transcrição foi investigada por ensaio de competição com oligonucleótido não marcado com [-32P]ATP, presente num excesso de 60-100 vezes. Para isso, os extractos nucleares foram em primeiro lugar incubados com o oligonucleótido não marcado, durante 20 minutos, à temperatura ambiente, tendo-se procedido depois à incubação com os radio-oligonucleótidos, segundo o protocolo acima descrito. Nestes ensaios de competição a presença do oligonucleótido não marcado faz desaparecer a banda específica da ligação oligonucleótido - factor de transcrição. Paralelamente ao ensaio de competição com os oligonucleótidos para os factores de transcrição AP-1 ou NF-B, os extractos nucleares foram incubados com um excesso de oligonucleótido não marcado para outro factor de transcrição, o Oct-1, e posteriormente incubados com os radio-oligonucleótidos para o AP-1 ou NF-B. Este ensaio funciona assim como um controlo para o ensaio de competição efectuado com os oligonucleótidos para o AP-1 ou o NF-B, uma vez que o oligonucleótido para o Oct-1 não compete com qualquer um dos radio-oligonucleótidos usados.

2.5 Análise de Western
Na análise de western blot as proteínas presentes em extractos celulares foram separadas por electroforese em gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes, na presença de SDS (SDS-PAGE), tendo sido depois electrotransferidas para uma membrana de difluoreto de polivinildieno (PVDF). As proteínas de interesse para o estudo foram identificadas por incubação das membranas com anticorpos específicos (anticorpos primários). A detecção dos anticorpos primários foi feita após incubação das membranas com um anticorpo secundário (dirigido contra as imunoglobulinas da espécie em que foi produzido o anticorpo primário), conjugado com fosfatase alcalina ou peroxidase do rábano. Estas enzimas por sua vez catalizam reacções nas quais o produto formado emite fluorescência ou luminescência, o que permite a detecção e quantificação relativa da proteína em estudo.

2.5.1 Preparação de extractos totais
Após os tratamentos experimentais indicados, as células foram lavadas duas vezes com PBS a 4°C, e foram colocadas em tampão de lise (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 1 %, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM, Na3VO4 2 mM, NaF 50 mM, pH 7,4) ao qual foi adicionando, imediatamente antes de usar, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, E 64 10 M, benzamidina 20 g/ml, e pepstatina A 25 g/ml. Alternativamente, ao tampão de lise foi adicionado DTT 1 mM e um conjunto de inibidores de proteases (Complete Mini). As células foram recolhidas das caixas de Petri para tubos de 1,5 ml e homogeneizadas durante 30 segundos por sonicação (intensidade média, 6 vezes 5 segundos, separadas por intervalos de 5 segundos). Após uma incubação de 20 minutos a 4°C, os lisados foram centrifugados a 12000 x g, durante 20 minutos, a 4°C (Eppendorf Centrifuge 5402). O sobrenadante (extracto total) foi recolhido e conservado a -20°C. A concentração de proteína foi determinada usando o método do ácido bicinconínico, com um conjunto de reagentes da Pierce.

2.5.2 Preparação de extractos membranares de células HEK-GluR4
As células HEK-GluR4 foram lavadas 2 vezes com PBS a 4°C, e foram colocadas em tampão hipotónico (Na2HPO4 10 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, NaF 50 mM, Na3VO4 1 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, pH 7,0) ao qual se adicionou, imediatamente antes de usar, DTT 1 mM e um conjunto de inibidores de proteases (Complete Mini). As células foram recolhidas para tubos de 1,5 ml e homogeneizadas por sonicação durante 50 segundos (intensidade média, 5 vezes 10 segundos, separadas por intervalos de 5 segundos). Após uma incubação de 20 minutos a 4°C os lisados foram centrifugados a 12000 x g, durante 5 minutos, a 4°C (Eppendorf Centrifuge 5402). O sedimento foi lavado duas vezes em tampão hipotónico, tendo sido centrifugado a 12000 x g, durante 5 minutos, a 4°C, entre as lavagens.
O sedimento foi solubilizado em 75 l de tampão (NaCl 100 mM, Na2HPO4 10 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, NaF 50 mM, Na3VO4 1 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, pH 7,0) com 1 % de dodecilsulfato de sódio (SDS, sodium dodecylsulfate) e foi posteriormente diluído com 375 l de tampão contendo 1% de Triton X-100. Ao tampão foi adicionado DTT 1 mM e um conjunto de inibidores de proteases (Complete Mini), imediatamente antes de usar. A solubilização do sedimento decorreu durante 20 minutos a 4°C, e para uma melhor homogeneização sonicou-se durante 30 segundos (intensidade média, 6 vezes 5 segundos, separadas por intervalos de 5 segundos). Procedeu-se depois a uma centrifugação a 12000 x g, durante 5 minutos, a 4°C, para remover a fracção insolúvel, e o sobrenadante foi recolhido e conservado a –20°C. A concentração de proteínas membranares foi determinada usando o método do ácido bicinconínico, com um conjunto de reagentes da Pierce.
2.5.3 Electroforese em gel de poliacrilamida e imunodetecção (Western Blot)
As proteínas dos extractos celulares foram desnaturadas por fervura (5-10 minutos) em solução desnaturante [solução desnaturante 5 x: glicerol 43,5 % (v/v), -mercaptoetanol 21,7 % (v/v), SDS 13,0 % (p/v), Tris-HCl 543 mM, pH 6,7, azul de bromofenol 0,05 % (p/v)], e separadas por electroforese em géis de poliacrilamida em condições desnaturantes, na presença de SDS, de acordo com procedimento descrito por Laemmli (Laemmli, 1970). Os géis de separação foram preparados com 12 % ou 7,5 % de acrilamida, conforme o peso molecular das proteínas de interesse. Na electroforese usou-se um tampão com Tris base 100 mM, bicina 100 mM, e SDS 0,1 % (p/v). O sistema de electroforese usado foi o Mini-Protean II Cell (BioRad).
Para a análise por imunodetecção, as proteínas foram electrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinildieno (PVDF) previamente activadas em metanol. O sistema de electrotransferência usado foi o TransBlot Cell (BioRad). A electrotransferência decorreu durante a noite, a 30 V, à temperatura ambiente ou, alternativamente, durante 2 horas a 500 mA, a 10°C. Neste processo usou-se um tampão com Tris base 12,5 mM, glicina 96 mM, e metanol 20 % (v/v). Para bloquear as ligações não específicas dos anticorpos, as membranas foram previamente incubadas durante 1 h, à temperatura ambiente, com 5 % ou 0,5 % (p/v) de leite magro, em Tween 20 0,1 % (v/v) preparado em TBS (TBS, Tris Buffer saline: Tris 20 mM, NaCl 137 mM, pH 7,6; TBST: Tween 20 0,1 % (v/v) em TBS). Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário diluído numa solução de TBST com 0,5 % (p/v) de leite magro, durante 1 h à temperatura ambiente ou, alternativamente, durante a noite a 4°C. Após incubação com o anticorpo primário as membranas foram lavadas, durante 25 minutos (5 vezes 5 minutos), em solução de TBST com 0,5 % (p/v) de leite magro, de forma a eliminar o anticorpo que não ligou. As membranas foram depois incubadas durante 1 h, à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário conjugado com a fosfatase alcalina ou com a peroxidase do rábano, diluído numa solução de TBST com 0,5 % (p/v) de leite magro. Depois de uma nova série de lavagens, em TBST com 0,5 % (p/v) de leite magro, as membranas foram reveladas com o reagente ECF (Enhanced Chemifluorescence, Quimiofluorescência Melhorada), quando se usou o anticorpo secundário conjugado com a fosfatase alcalina, ou com o reagente ECL (Enhanced Chemiluminescence, Quimioluminescência Melhorada), quando se usou o anticorpo secundário conjugado com a peroxidase do rábano. No caso das membranas reveladas com ECF a marcação foi visualizada num detector STORM (Molecular Dynamics), enquanto que para as membranas reveladas com ECL a visualização foi feita com um filme sensível à quimioluminescência (Hyperfilm ECL).
As membranas que foram utilizadas para uma marcação posterior com outro anticorpo (“reprobing”) foram tratadas com SDS 2 % e 2-mercaptoetanol 100 mM, em solução de Tris 62,5 mM pH 6,7, durante 30 minutos, a 50°C, de modo a remover a ligação dos anticorpos usados na primeira imunodetecção. Após lavagem com TBST, procedeu-se de novo ao bloqueio da membrana. O protocolo de imunodetecção com um novo anticorpo primário foi depois efectuado tal como acima descrito.


2.6 Determinação da concentração de cálcio livre intracelular
A determinação da concentração citoplasmática de Ca2+ livre, [Ca2+]i, foi feita por espectroscopia de fluorescência, usando a sonda fluorescente Fura-2, cuja estrutura tem por base a molécula de EGTA, à qual foram adicionados grupos cromóforos. A ligação de Ca2+ à sonda leva a um desvio do comprimento de onda óptimo de excitação de 360 nm para 340 nm, havendo um aumento da intensidade de fluorescência a esse comprimento de onda com o aumento da concentração de Ca2+ livre (Grynkiewicz et al., 1985). As células HEK-GluR4 foram incubadas com a forma hidrofóbica éster acetoximetilo da sonda Fura-2 (Fura-2/AM), a qual difunde facilmente através da membrana celular. Uma vez no citoplasma as ligações éster são clivadas por esterases intracelulares (Tsien, 1981), expondo cinco cargas negativas que dificultam a saída do indicador para o meio extracelular, favorecendo a sua acumulação intracelular.
As células HEK-GluR4, cultivadas em caixas de Petri de 60 mm de diâmetro, foram colocadas em suspensão em 1 ml de solução salina (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, glicose 6 mM, HEPES 10 mM, Ca2+ 2,5 mM, MgCl2 1,5 mM, pH 7,4), tendo sido depois transferidas para um tubo de 1,5 ml e incubadas a 37°C, com Fura 2/AM 5 M, durante 45 minutos, sob agitação suave. Após este período de incubação, necessário para a hidrólise da ligação éster da sonda pelas esterases intracelulares, o Fura 2/AM que não foi internalizado foi eliminado por lavagem em 1 ml de meio salino. Foram efectuadas 3 lavagens separadas por centrifugação a 16000 x g durante 10 segundos (Eppendorf Centrifuge 5415).
As determinações da [Ca2+]i foram efectuadas num espectrofluorímetro Perkin-Elmer LS-5B, a 37°C, após ressuspensão das células em 2 ml de meio salino (NaCl 132 mM, KCl 4 mM, glicose 6 mM, HEPES 10 mM, Ca2+ 2,5 mM, MgCl2 1,5 mM, pH 7,4). As células foram excitadas a 340 nm e a emissão de fluorescência foi registada a 510 nm, de 0,5 em 0,5 segundos, usando fendas de 5 nm. No fim de cada ensaio a calibração foi efectuada com ionomicina 30 M, de modo a saturar a sonda intracelular com Ca2+ e obter a fluorescência máxima (Fmax), e com MnCl2 3 mM, para obter a autofluorescência (AF). A [Ca2+]i foi calculada por conversão dos valores da intensidade de emissão de fluorescência segundo a equação de calibração da sonda, para medições a um comprimento de onda único (Grynkiewicz et al., 1985):
[Ca2+]c = KD(F-Fmin)/(Fmax-F),
sendo Fmin = AF + 1/3(Fmax-AF). A constante aparente de dissociação (KD) do Fura-2 é da ordem de 224 nM, o que lhe confere grande sensibilidade na gama de variação da concentração intracelular de Ca2+ observada neste estudo (Grynkiewicz et al., 1985).

2.7 Imunocitoquímica
A avaliação da distribuição intracelular da proteína p65, um elemento do factor de transcrição NF-B, em culturas primárias de células da retina de pinto, foi efectuada por imunocitoquímica. Neste processo, as preparações celulares fixadas e permeabilizadas foram incubadas com um anticorpo específico para a proteína em estudo. O anticorpo primário foi depois detectado com um anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo e as preparações foram visualizadas por microscopia confocal.
Após o tratamento pretendido, as células da retina de pinto cultivadas em lamelas, foram lavadas e fixadas com paraformaldeído 2 % (p/v) em tampão fosfato, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. As células foram depois permeabilizadas com Triton X-100 0,5 % (v/v) em PBS, durante 5 minutos, e bloqueadas com soro normal de cabra a 20 % em PBS, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram incubadas durante a noite, a 4°C, com um anticorpo primário contra a proteína p65, produzido em coelho, diluído de 1:1000 em PBS, na presença de 5 % (v/v) de soro normal de cabra. Após a incubação com o anticorpo primário, as células foram lavadas 6 vezes, com PBS, durante 15 minutos, e em seguida foram incubadas durante 1 hora, à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário (produzido em cabra contra IgG de coelho) conjugado com AlexaTM488, diluído de 1:400 em PBS com 1 % (v/v) de soro normal de cabra. As células foram lavadas tal como descrito anteriormente e as lamelas foram montadas sobre meio de montagem “ProlongTM Antifade kit”, para reduzir o fotodecaimento da fluorescência. As células foram visualizadas por microscopia confocal, usando um sistema de imagiologia confocal MRC600 da BioRad acoplado a um microscópio de fluorescência Nikon Optiphot-2. Foi utilizado um laser misto de Kripton/Árgon em combinação com um filtro de 488 nm (excitação) e um filtro de 515 nm (emissão) para examinar a imunorreactividade da p65. A experiência controlo para avaliar a especificidade da ligação do anticorpo secundário consistiu em processar as preparações tal como acima descrito, excepto que se omitiu o anticorpo primário. Este controlo não apresentou qualquer marcação.

2.8 Análise estatística dos resultados
Os resultados dos ensaios de viabilidade celular e dos ensaios de activação dos factores de transcrição são apresentados como a média ± erro padrão do número de experiências indicado, em preparações diferentes. A análise estatística dos resultados foi efectuada usando o teste ANOVA seguido do teste de Dunnett ou de Bonferroni.
2.9 Materiais
Tripsina - Gibco BRL Life Technologies

Meio basal de Eagle (BME) - Sigma

Soro fetal de bovino (FCS) - Biochrom KG

Gentamicina - Gibco BRL Life Technologies

Poli-D-lisina - Sigma

Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) - Sigma

Geneticina (G418 sulfate) - Gibco BRL Life Technologies

MK-801 - Merk Sharp & Dhome Research Laboratories

CNQX - Tocris Cookson Ltd

CTZ - Tocris Cookson Ltd

LY 303070 - Eli Lilly Co.

SB 203580, PD 98059, e U0126 - Calbiochem-Novabiochem Corp.

MTT - Sigma

Iodeto de propídio, SYTO-13 e Hoechst 33342 - Molecular Probes



Dako fluorescent mounting medium - Dako

Ditiotreitol (DTT) - Sigma

Fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), trans-epoxisuccinil-L-leucilamido-4-guanidinobutano (E64), benzamidina e pepstatina A - Sigma

Complete Mini - Roche

Acrilamida/Bis (29:1) a 30 % - BioRad

Oligonucleótidos para os factores de transcrição AP-1, NF-B e Oct-1 - Santa Cruz Biotechnology

[-32P]ATP - Amersham Biosciences

Cinase de polinucleótidos T4 - USB

Coluna Sephadex G-50 - Amersham Biosciences

Universol - ICN

Poli(dI-dC).poli(dI-dC) - Amersham Biosciences

Membranas de celofane - Amersham Biosciences

Hyperfilm ECL - Amersham Biosciences

Membranas de difluoreto de polivinildieno (PVDF) - Boehringer Mannheim

Reagente ECF ou ECL - Amersham Biosciences

Fura-2/AM - Molecular Probes

Ionomicina - Calbiochem-Novabiochem Corp.

Soro normal de cabra - Chemicon International Inc.



ProlongTM Antifade - Molecular Probes

Anticorpos comerciais usados:

- Anticorpo policlonal produzido em cabra contra IgG + IgM (H + L) de rato, conjugado com peroxidase - Pierce.

- Anticorpo policlonal produzido em porco contra imunoglobulinas (maioritariamente IgG) de coelho, conjugado com peroxidase - Dako.

- Anticorpo policlonal produzido em cabra contra imunoglobulinas IgG (H + L) de coelho, conjugado com fluoróforo AlexaTM 488 - Molecular Probes.

- Anticorpo policlonal produzido em cabra contra imunoglobulinas IgG + IgM (H + L) de rato, conjugado com fosfatase alcalina - Amersham Biosciences.

- Anticorpo policlonal produzido em cabra contra imunoglobulinas IgG (H + L) de coelho, conjugado com fosfatase alcalina - Amersham Biosciences.

- Anticorpo policlonal contra a subunidade GluR4: anticorpo produzido em coelho, contra o peptídeo sintético KHTGTAIRQSSGLAVIASDLP, correspondendo à região do terminal carboxílico da subunidade GluR4 - Upstate Biotechnology.

- Anticorpo policlonal contra a MAPK-activa: anticorpo produzido em coelho, contra a forma activa da MAPK, usando um peptídeo fosforilado em dois resíduos de aminoácidos (Thr 183 e Tyr 185 da ERK2) que representa o núcleo catalítico activo da MAPK. O anticorpo reconhece ambas as isoformas da enzima (p44/ERK1 e p42/ERK2) - Promega.

- Anticorpo monoclonal produzido em rato contra a alfa-tubulina - Zymed.

- Anticorpo policlonal contra c-Fos: anticorpo produzido em coelho, contra um peptídeo correspondendo ao domínio altamente conservado da p62 c-Fos de origem humana. Este anticorpo reage também com as outras proteínas da família Fos, Fra-1, Fra-2 e Fos-B - Santa Cruz Biotechnology (sc-253).

- Anticorpo policlonal contra Fos B: anticorpo produzido em coelho, contra um peptídeo correspondente ao domínio central da proteína Fos B de ratinho. Este anticorpo não exibe reactividade cruzada com os outros membros da família Fos - Santa Cruz Biotechnology (sc-48).

- Anticorpo policlonal contra Fra-1: anticorpo produzido em coelho contra um peptídeo correspondente ao terminal amínico da proteína Fra-1 de rato. Este anticorpo não exibe reactividade cruzada com os outros membros da família Fos - Santa Cruz Biotechnology (R-20).

- Anticorpo policlonal contra Fra-2: anticorpo produzido em coelho contra um peptídeo correspondente ao terminal amínico da proteína Fra-2 de origem humana. Este anticorpo não exibe reactividade cruzada com os outros membros da família Fos - Santa Cruz Biotechnology (Q-20).

- Anticorpo policlonal contra c-Jun: anticorpo produzido em coelho contra um peptídeo correspondente ao terminal amínico da proteína p39 c-Jun de ratinho. Este anticorpo não exibe reactividade cruzada com Jun B ou Jun D - Santa Cruz Biotechnology (sc-45).

- Anticorpo policlonal contra Jun D: anticorpo produzido em coelho contra um peptídeo correspondente ao terminal carboxílico da proteína p39 Jun D de ratinho. Este anticorpo não exibe reactividade cruzada com os outros membros da família Jun - Santa Cruz Biotechnology (sc-74).

- Anticorpo policlonal contra Jun B: anticorpo produzido em coelho contra um peptídeo correspondente ao terminal amínico da proteína p39 Jun B de ratinho. Este anticorpo não exibe reactividade cruzada com os outros membros da família Jun - Santa Cruz Biotechnology (sc-46).

- Anticorpo policlonal contra ATF-2: anticorpo produzido em coelho contra um peptídeo correspondente ao terminal carboxílico da proteína ATF-2 de origem humana - Santa Cruz Biotechnology (C-19).



- Anticorpo policlonal contra a subunidade p65 do NF-B: anticorpo produzido em coelho contra um peptídeo correspondente ao terminal carboxílico da proteína p65 de origem humana - Serotec.
Todos os outros reagentes usados possuíam um elevado grau de pureza, e foram obtidos da Sigma ou da Merk.

2.10 Soluções de fármacos usadas
As soluções concentradas de Fura-2/AM, de ionomicina, de CNQX, de CTZ, de LY 303070, de SYTO-13, de SB 203580, de PD 98059 e de U 0126, foram preparadas em dimetilsulfóxido. As outras soluções concentradas foram preparadas em solução aquosa.


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