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RELATÓRIO DE PROJETO DE PESQUISA
Nome do Projeto: Uso do Bacillus subtillis como probióticos, para controle de Vibrios em cultivos de camarões.

Protocolo:

Nome do(a) Proponente ou Orientador(a): Prof. Dr. Dile Pontarolo Stremel

Nome do(a) Bolsista: Joselaine Cardoso de Jesus

Campus/Unidade: Unisul / Tubarão
Data do Relatório: 15/09/2008
Tipo do Projeto:

( ) PUIC Disciplina ( ) PUIC Continuado ( ) PUIC Individual

( X ) PIBIC


  1. Introdução

A ocorrência de vibrios é algo que vem preocupando os produtores e profissionais do segmento, pois, para o controle deles vêm-se utilizando antibióticos que são adicionados à água. Embora esse tratamento tenha uma resposta mais rápida às doenças bacterianas, pode produzir um efeito contrário, pois, com o uso de antibióticos em alimentos de origem animal, a resistência da bactéria patogênica associada ao animal é aumentada e pode ser transmitida aos humanos. Mac MILLAN (apud TORO, 2005)

Em 1960, Richard Parker usou pela primeira vez o termo “probiótico”, que significa “a favor da vida”. A partir daí, enfatizaram-se os estudos sobre a população de microrganismos não patogênicos presente no trato digestório, tanto dos animais domésticos como dos seres humanos. Jin et al. (apud FURLAN et al., 2004)

O uso de bactérias benéficas (probióticas) para inibir patógenos através de processos naturais, é um meio mais seguro e efetivo do que o uso de antibióticos para promover a saúde animal. O controle de patógenos com probióticos nos cultivos de camarão tem um potencial considerável. GARCÍA e MASSAM (apud TORO, 2005)

Nesta pesquisa foram realizados testes utilizando o bacillus subtilis como agente probiótico, de modo a verificar o potencial antagonista em cepas selecionadas de vibrios.
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Obter complemento nutricional a base de microrganismos com características probióticas que permitam o controle de doenças comuns em cultivos de camarões, ocasionadas por microrganismos patogênicos, além de proporcionar um fortalecimento do sistema imune.
2.2 Objetivos Específicos
-Selecionar cepas de bacillus probióticos;

- Efetuar teste in vitro, para verificar o potencial antagonista entre os isolados de bacillus e vibros:

- Teste de inibição pelo método de difusão em orifícios;

- Teste de inibição por difusão em ágar;

- Teste de inibição por disco-difusão.


  1. Material e Métodos




    1. Métodos de Testes in vitro




      1. Método da Difusão em Orifícios (well difusion assay).

Os vibrios serão pré incubados a 28 °C por 2 dias e 5μl dessa cultura será espalhado sobre as placas de ágar. Cultura dos Bacillus pré incubada por 3 dias, será centrifugado e o líquido sobrenadante filtrado através um filtro menbrana de 0,22μm, para obter extrato livre de células. Um volume de 100 μl de extrato de Bacillus livre de células foi introduzida em poços em meio de ágar e incubados pelo o período de 24-48 h em 28°C. A atividade será definida quando o diâmetro a zona inibitória avançar em torno do poço. LEWUS e MONTVILLE (1991) Apud MAZO (2002).




      1. Método da Disco-Difusão.

Inocular uma alçada da colônia do vibrio em caldo peptona e incubar á 35°C por 24 horas. Semear 0,1 ml da cultura de vibrio em placa de ágar Mueller Hinton e espalhar uniformemente com alça de Drigalski. Transferir discos de ágar contendo a cultura de Bacillus subtilis para a placa de ágar Mueller Hinton já semeada com vibrio. Após 24 horas verificar o halo de inibição. TAGG e Mc GIVEN (1971) apud TORO (2005).




      1. Método de difusão em ágar

Para testar a produção e de metabólitos produzidos por isolados de Bacillus spp., colônias da bactéria são transferidas para Erlenmeyers de 250 ml, contendo 100 ml de caldo BHI. Após a incubação, o caldo será centrifugado e o líquido sobrenadante filtrado através um filtro menbrana de 0,22μm, para obter extrato livre de células. Em placas de petri com capacidade de 20 mL, serão colocadas 3 mL dos extrato e 17 mL de ágar Mueller Hinton e após a solidificação do meio será semedado a cultura de vibrios e acompanhar o crescimento comparando com uma placa testemunha. ROGERO et al(2003).




      1. Método Coloração de Gram

- Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante básico), esperar um minuto;

- Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando-a levemente com água corrente ou destilada;

- Cobrir o esfregaço com solução de lugol durante um minuto;

- Descorar o esfregaço usando uma solução de álcool – acetona (gotejar a solução até que não saia mais o corante, ou deixar sobre a lâmina por 30 segundos);

- Cobrir o esfregaço com solução de safranina, durante 30 segundos;

- Lavar levemente com água corrente;

- Esperar a lâmina secar naturalmente ao ar livre, ou enxugá-la delicadamente com papel filtro, através de leve compressão do mesmo sobre a lâmina. (SILVA, 2001)




    1. Materiais

- Kit coloração de Gram;

- Ágar Mueller Hinton

- Ágar Marine

-Ágar Nutriente

- Caldo peptona

- Cloreto de Sódio

- Placas de petri descartáveis.

- Erlenmeyers 250 mL

- Alça de Drigalski

- Filtro membrana Millipore 0,45 µm;

- Filtro membrana de Millipore 0,22μm;

- Caldo BHI

- Micropipeta

- Ponteiras autoclaváveis

- Bomba a vácuo

- Câmara de fluxo laminar

- Centrifuga

- Autoclave

4. Resultados:
4.1 Método da Difusão em Orifícios (Well Difusion Assay)

As três espécies de vibrios (Vibrio parahaemoelyticus, V. vulnificus e V. fluvialis) foram pré incubadas a 35 °C por 24 horas em caldo petona 5% e 5µL dessa cultura foi espalhado sobre as placas de Agar Mueller Hinton. A cultura dos Bacillus subtillis PR29 e ATCC 9372, pré incubada por 7 dias em caldo BHI, foi centrifugada (Centribio, modelo 80-2B), a 3500 rpm por 20 minutos, para que ocorresse maior compactação. O líquido sobrenadante foi filtrado através um filtro membrana Millipore, poro 0,45 µm diâmetro 47 mm, utilizando bomba à vácuo (Prismatec, modelo X13A) na câmara de fluxo laminar (Marconi, modelo Mini-Flow I), para obter extrato livre de células.

Após a semeadura dos Vibrio, foram feitos três furos no ágar de cada placa com ponteiras autoclavadas (Phoenix, modelo Autoclave Vertical 75 plus), conectadas a mangueira da bomba a vácuo, Figura 01 e 02. Em um dos orifícios foi colocada a testemunha, e no outro foi introduzido 6 µL do extrato de Bacillus subtillis PR29 e 6 µL do extrato de Bacillus subtillis ATCC9372 em outro orifício e incubados pelo período de 24 horas á 35°C. O experimento foi realizado em triplicata.


Figura 01 - Sistema para perfuração do ágar.


Figura 02 - Perfuração do ágar.
Após 24 horas de incubação constatou-se a não ocorrência de halo de inibição, conforme o quadro 01.
Quadro 01 – Resultados do teste difusão em orifícios, o resultado é expresso em positivo (ocorrência de halo) e negativo (não ocorrência de halo).


4.2 Método Disco-Difusão
Foi semeado 0,1 mL da cultura de Vibrio (Vibrio parahaemoelyticus, V. vulnificus e V. fluvialis), uniformemente, em placa de Agar Mueller Hinton, e transferido discos de ágar contendo a cultura de Bacillus subtillis PR 29 e TCC 9372, para a placa de Agar Mueller Hinton já semeada com Vibrio. Após 24 horas verificou-se um halo de crescimento ao redor do disco. Foi feito uma lâmina com a colônia ao redor do disco de ágar e feita à coloração de Gram, conforme item 2.1.4 e constatou-se a presença de bactérias Gram positivas e negativas Figura 03.



Figura 03 - Microscopia de varredura, lente de aumento 1600 vezes.
O teste foi realizado em duplicata. No quadro abaixo estão apresentados os resultados.
Quadro 02 – Resultados do teste disco-difusão, o resultado é expresso em positivo (ocorrência de halo) e negativo (não ocorrência de halo).


4.3 Método Difusão em Ágar
Colônias dos Bacillus subtillis PR29 e ATCC 9372 foram transferidas para Erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL de caldo BHI e incubados por 5 dias. O caldo foi autoclavado. Em placas de Petri com capacidade de 20 mL, foram colocados 3 mL dos extratos e 17 mL de agar. Foram utilizados dois meios de cultivo, Agar Marine e Agar Mueller Hinton. Após a solidificação do meio, foi semeada a cultura de Vibrio (Vibrio parahaemoelyticus, V. vulnificus e V. fluvialis) e acompanhado o crescimento comparando com uma placa testemunha, contendo somente ágar.

Os testes foram realizados em duplicata e com testemunha, em dois tipos de ágar e com três espécies de Vibrio. Os resultados estão descritos no quadro abaixo:



Quadro 03 – Resultados do teste difusão em ágar, o resultado é expresso em positivo (não houve crescimento) e negativo (não houve crescimento).
5. Conclusões
Com os testes realizados não foi possível comprovar o antagonismo dos Bacillus subtillis PR29 e ATCC 9372 e de seus metabólitos sobre os isolados V. parahaemolyticus, V. fluvialis e V. vulnificus. Porém, no teste disco-difusão, percebeu-se o crescimento dos dois microorganismos, portanto não refutando a hipótese de usar Bacillus subtillis PR29 e ATCC 9372 como probióticos nos cultivos de camarões. Seria necessário um bioensaio para avaliar o comportamento dos bacilos no trato digestivo do camarão, pois sabe-se que a inibição se dá por vários mecanismos. No bioensaio os bacilos poderão ser avaliados, quanto à:

• Colonização em sítios do trato digestivo, não permitindo a fixação de

vibrios;

• Competição pelo espaço e/ou competição de nutrientes;

• Estimulação da imunidade do hospedeiro.

Antes do teste in vivo, os bacilos devem ser testados quanto a sua resistência às altas concentrações de bile, baixo pH e concentrações elevadas de NaCl, que são condições do trato digestivo do camarão. Como não houve inibição dos vibrios pelos metabólitos de Bacillus subtillis PR29 e ATCC 9372 os bacilos devem chegar viáveis ao trato digestivo, para ser melhor avaliado no bioensaio.



Para a realização de bioensaio sugere-se que a cultura de Bacillus subtillis PR29 e ATCC 9372 seja liofilizada e misturada na ração dos camarões. Para isso, deve-se avaliar a viabilidade do bacilo após a liofilização, pois o bacilo deve chegar viável ao trato digestivo do animal.
6. Referências
ARANA, L.A.V. Aqüicultura e desenvolvimento sustentável: subsídios para a formulação de políticas de desenvolvimento da aqüicultura brasileira. Florianópolis: Editora da UFSC, 1999.
AQUALIDER. Os perigos do uso de antibióticos na Aquicultura. Disponível em : Consulta 28/05/2008.
DEVARAJA, T. N.; YUSOFF, F. M.; SHARIFF, M. Changes in bacterial populations and shrimp production in ponds treated with commercial microbial products. Aquaculture, nº 226 p 245 – 256, 2002.
Farzanfar, A. The use of probiotics in shrimp aquaculture. FEMS Immunology & Medical Microbiology, Volume 48, 2006, Issue 2: 149-158.
FURLAN, R.L., MACARI, M., LUQUETTI, B.C. Como avaliar os efeitos do uso de prebioticos, probioticos e flora de exclusão competitiva. 5° Simpósio Técnico de Incubação, matrizes de corte e nutrição. Balneário Camboriú, SC. 2004.
Gullian, M.; Thompson, F.; Rodriguez, J. Selection of probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect in Penaeus vannamei. Aquaculture 233, 2004, p. 1 –14.
IRIANTO, A.; AUSTIN, B. Probiotics in aquaculture. Journal of Fish Diseases vol. 25, 633–642, 2002.
MAZO, J. Z.; SANT’ANNA, E. S.; et. al. Detecção de Bacteriocinas Produzidas por Lactobacillus plantarum BN em Melaço de Cana-de-Açúcar Sob Fermentação Submersa. Boletim Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, Vol. 20, No 1, 2002.
ROGERO, Sizue Ota et al . Teste in vitro de citotoxicidade: estudo comparativo entre duas metodologias. Mat. Res.,  São Carlos,  v. 6,  n. 3,  2003.  Disponível em:. Acesso em: 16/05/2008.
SILVA, Neusely; SILVEIRA, Neliane Ferraz de Arruda. Manual de métodos de

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TORO, C. R.; Uso de bactérias probióticas na alimentação de camarões Litopenaeus vannamei como inibidoas de microorganismos patogênicos e estimulantes do sistema imune. 2005 Disponível: <http://www.ppgbiotec.ufpr.br/teses_dissertacoes/teses/2005.html>. Consulta 15/07/08.
Vaseeharan, B.; Ramasamy, P. Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon. Letters in Applied Microbiology,2003, Volume 36, Issue 2: 83-87.




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