Manual de procedimentos básicos em microbiologia



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PNEUMONIA HOSPITALAR


Considerando-se as diferentes topografias associadas às infecções hospitalares, as localizadas no trato respiratório inferior, têm grande importância pela freqüência em que ocorrem e pela morbidade associada. Estas infecções são classificadas basicamente em quadros de traqueobronquite e pneumonia.


A pneumonia de origem hospitalar é definida como aquela que aparece após um período maior ou igual a 48 horas de admissão e não está incubada no momento da hospitalização. Segundo dados da literatura, ocorre entre 6 a 10 casos a cada 1000 admissões hospitalares.

Entre as pneumonias, aquelas associadas com ventilação mecânica através de entubação orotraqueal ou traqueostomia, são as mais freqüentes. São definidas para pacientes sob ventilação mecânica em um período igual ou superior a 48 horas. Nesta situação a incidência de infecção é de 7 a 21 vezes maior à que ocorre em pacientes que não necessitam de respirador.


Dentre as infecções hospitalares, a infecção pulmonar é a que leva a morte com maior freqüência, com um risco maior na Unidade de Terapia Intensiva. A prevalência de pneumonias varia entre 10 e 65%, com 13 a 55% de casos fatais. Neste mesmo tipo de Unidade, dados do National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) mostram a taxa de infecção respiratória associada à ventilação mecânica por 1000 procedimentos-dia, variando de 5 casos em UTI pediátrica a 13 casos em UTI cirúrgica.
De uma maneira geral os microrganismos podem alcançar o trato respiratório pela aspiração de secreções da orofaringe, pela inalação de aerossóis contendo bactérias, pela translocação de microrganismos do trato gastrointestinal ou pela disseminação hematogênica de um foco a distância. Ainda, para que a infecção respiratória ocorra é necessário existir a perda das defesas do hospedeiro, um inóculo suficiente para alcançar o trato respiratório ou a presença de um microrganismo altamente virulento.
Os agentes mais freqüentemente isolados são:

  • Bacilos Gram negativos

  • Enterobactérias: Klebsiella spp., E. coli, Enterobacter spp.

  • Bacilos Gram negativos não fermentadores: P. aeruginosa, Acinetobacter baumanii e outras espécies, etc.

  • Cocos Gram positivos, principalmente Staphylococcus aureus.

  • Outros agentes, tais como Legionella pneumophila e Vírus Respiratório Sincicial (VRS) aparecem em casos de surto e em pacientes imunodeprimidos, assim como Aspergillus spp. e Pneumocystis carinii.


Patógenos isolados em 4.389 pneumonias em UTI nos Estados Unidos de 1992–97 NNIS


Patógenos

%

Pseudomonas aeruginosa

21

Staphylococcus aureus

20

Enterobacter spp.

9

Klebsiella pneumoniae

8

Acinetobacter spp.

6

Candida albicans

5

Escherichia coli

4

Enterococcus spp.

2

Outras enterobactérias

8

Outros fungos

2,8

Vários critérios utilizados para definição de pneumonia hospitalar foram propostos. Em geral, incluem a presença de um novo ou progressivo infiltrado pulmonar, febre, leucocitose e secreção traqueo-brônquica purulenta.


Muitos destes achados são inespecíficos já que febre pode ser causada por diversos fatores como: reação a drogas, infecção em outro foco, transfusão sanguínea e resposta inflamatória extra-pulmonar.
O mesmo ocorre com a congestão, presente em embolia pulmonar, atelectasia, insuficiência cardíaca, hemorragia pulmonar, trauma pulmonar, tumor, aspiração química e reação à drogas.





Diagnóstico laboratorial das Pneumonias



Recursos Diagnósticos





  • Exame físico

  • Exame do escarro

  • Aspirado transtraqueal

  • Broncoscopia com fibra óptica e lavado bronco-oalveolar

  • Aspirado endotraqueal cego

  • Biópsia pulmonar

  • Hemocultura (1 a 16% de positividade)

  • Exames imunológicos (imunofluorescência, ELISA, etc.)

  • Punção de derrame pleural para realização de exames bioquímicos, citológicos e microbiológicos.

  • Raio X simples (AP + perfil)

  • Tomografia computadorizada

O diagnóstico das infecções do trato respiratório inferior, do ponto de vista microbiológico, é dificultado pela contaminação da amostra, em nível do trato respiratório superior, durante a coleta.


Critérios de aceitação de amostras clínicas para exame


Amostras aceitáveis

Amostras inaceitáveis

Escarro

Saliva (enviada como escarro)

Aspirado traqueal ou transtraqueal

Escarro coletado por 24 horas

Lavado bronco-alveolar, escovado brônquico e biópsia brônquica

Swab endotraqueal, cânula ou tubo endotraqueal

Punção pulmonar e biópsia pulmonar






Escarro

Apesar de poder ser útil em pacientes com tosse produtiva e com capacidade de expectorar e a presença de escarro purulento encontrar-se na maioria dos critérios utilizados para o diagnóstico de pneumonias, a análise desta secreção é bastante controvertida do ponto de vista de sensibilidade e especificidade.


Aspectos da análise macroscópica do escarro que podem ser úteis para sugestão de agentes ou patologias: Cor, quantidade, consistência e cheiro.


  • Escarro purulento – pneumonia bacteriana (embora nas pneumonias por vírus ou micoplasma a infecção secundária pode oferecer os mesmos achados em cerca de 30 a 50% dos casos)

  • Expectoração matinal, abundante e fétida - bronquiectasia

  • Expectoração escassa ou aquosa (mucóide) - pneumonias atípicas

  • Escarro avermelhado, mucóide - Klebsiella pneumonia

  • Escarro fétido associado a pneumonia aspirativa - anaeróbios


Bacterioscopia
A bacterioscopia do escarro pela coloração de Gram é um recurso simples, rápido e barato, podendo ser muito útil para orientação terapêutica quando são atendidos os seguintes itens:

  • Um material purulento e representativo é analisado;

  • Os analistas são experientes;

  • Informações clínicas e/ou o clínico participam da interpretação;

  • Os achados são bem definidos, como por exemplo, o predomínio ou presença de mais de 10 cocobacilos Gram positivos em forma de chama de vela, característicos de pneumococo em imersão (X1000) - a especificidade nesse caso é de 85%.

Algumas medidas relacionadas à coleta e processamento da amostra podem tornar os resultados obtidos com este espécime de maior utilidade. A remoção de próteses e gargarejo com água imediatamente antes da coleta pode reduzir substancialmente a contaminação da amostra. O único cuidado é impedir o uso de substâncias com conteúdo bactericida.


Prefere-se colher a primeira amostra de escarro da manhã por ser um material mais concentrado, utilizando-se a porção mais purulenta para análise. A coleta por um período de 24 horas é inadequada, já que durante o dia passa a ocorrer diluição da amostra, morte de alguns agentes fastidiosos, e em contrapartida, o crescimento bacteriano de outros microrganismos.
Segundo os achados de LENTINO e LUCKS, relatados por KONEMAN et al (1997), a interpretação do resultado das culturas de escarro em relação às pneumonias foi de que:

  • 26,5% de amostras de escarro purulento eram de pacientes mostrando nenhum sinal clínico ou radiológico de pneumonia.

  • 40% das amostras de escarro provenientes de pacientes com pneumonia não eram profundamente expectorados, refletindo a presença de secreção oral.

  • Somente 10% de pacientes produzindo escarro não purulento tinham pneumonia.

  • Somente 56,8% dos pacientes com pneumonia produziam escarro purulento.

Ainda em casos comprovados de pneumonia pneumocócica, com bacteremia e escarro revelando o pneumococo na coloração de Gram podem apresentar cerca de 50% de culturas de escarro negativas, o mesmo podendo ocorrer com pneumonias por Haemophylus. A presença de enterobactérias em culturas de escarro deve ser interpretada com muita cautela, pois em cerca de 1/3 das culturas estas bactérias provenientes da orofaringe podem contaminar o material obtido para análise. A avaliação da qualidade do escarro, considerando a proporção entre o número de células epiteliais e leucócitos, é um procedimento que deve ser considerado de rotina, para caracterizar a aceitabilidade da amostra ou não.


Através da coloração de Gram (observação de pelo menos 10 campos com aumento de 10X), as amostras devem ser classificadas em grupos de acordo com as tabelas abaixo. São significativos os materiais do grupo 5 ou quando a quantidade de células epiteliais, neutrófilos e muco resultarem em somatória positiva. Recomenda-se que escarros não qualificados, não sejam semeados e que o fato seja reportado ao requisitante do exame.
Avaliação da qualidade do escarro


Grupos

Células epiteliais

Leucócitos




Neutrófilos

Score”

Células Epiteliais

Score”

Grupo 1

≥ 25

≤ 10




< 10

0

10-25

-1

Grupo 2

≥ 25

10-25




10-25

+1

> 25

-2

Grupo 3

≥ 25

≥ 25




> 25

+2







Grupo 4

10-25

≥ 25




Muco

+1







Grupo 5

<10

≥ 25















No caso da necessidade do processamento da amostra nestas condições, é recomendável uma observação no laudo final do exame, dizendo que o material coletado está contaminado com material de orofaringe. Faz-se exceção a esta regra, escarro com o objetivo de diagnosticar presença de micobactérias, vírus, fungos (Paracocidioidis brasiliensis, Histoplasma spp., etc.) e aqueles provenientes de pacientes imunodeprimidos.




  • Pneumocistis carinii - para diagnóstico de pneumonia por Pneumocistis carinii em pacientes com HIV ou imunossuprimidos, o escarro pode ser útil em mais de 50% dos casos, pelo uso da coloração de Giemsa ou Gomori methenamina prata ou azul de toluidina ou ainda de imunofluorescência com anticorpos monoclonais que apresentam uma sensibilidade de 80% e especificidade de 90%.

  • Legionella pneumophilia - para diagnóstico de legionelose (Legionella pneumophlia) o escarro ou outros materiais, obtidos por vias invasivas ou não, podem ser úteis no diagnóstico pela imunofluorescência direta com anticorpos monoclonais.

  • Chlamydia pneumoniae - os recursos imunológicos para teste no escarro (Elisa e imunofluorescência) oferecem baixa sensibilidade e especificidade para caracterização da pneumonia por Chlamydia pneumoniae. Quando agentes como Mycobacterium tuberculosis, Legionella spp., e Pneumocistis carinii são encontrados no escarro, devem ser considerados patogênicos, independente da avaliação de qualidade do escarro.

A amostra deve ser encaminhada diretamente ao laboratório e se não processada no prazo de 1-2 horas pode resultar em perda de patógenos fastidiosos e em proliferação de bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores).


Indicação de outras técnicas para obtenção de material para diagnóstico de pneumonia:

  • má resposta terapêutica

  • gravidade do quadro ou paciente imunossuprimido

  • falta de produção de escarro

  • exames realizados não foram conclusivos (não isolou nada ou isolou enterobactérias, ou Candida ou mais de um agente)

  • possibilidade de superinfecção

As técnicas broncoscópicas caracterizam-se pela possibilidade de visualizar diretamente a árvore respiratória levando a menor risco de dano e direcionamento do fibroscópio ao local desejado, enquanto as não broncoscópicas podem ser realizadas mais rapidamente com menor risco de desaturação de oxigênio.



Aspirado de secreção traqueal

Apesar de aspirados de secreção traqueal serem rapidamente obtidos em pacientes entubados, esta é uma amostra bastante questionável, devido a sua baixa especificidade. Isto se deve ao fato de que a colonização endotraqueal ocorre rapidamente após a entubação e ventilação mecânica.


A utilização de técnicas quantitativas de aspirados endotraqueais feito às cegas, com o objetivo de diferenciar colonização de infecção com valores de corte de > 105 UFC/ml, é proposto por alguns autores (Jourdain & cols, 1995).
A sensibilidade preditiva de pneumonia associada a ventilação foi comparável com o BAL e com a técnica do escovado protegido, embora menos específico. Alguns trabalhos mostram até 82% de sensibilidade e 83% de especificidade para o aspirado endotraqueal, mas não há unanimidade.
Independentemente da metodologia empregada, tende a mostrar resultados mais favoráveis associados ao valor preditivo negativo e sua melhor indicação é quando não se pode fazer a broncoscopia. A mortalidade da pneumonia associada à ventilação mecânica não mostrou diferença quando a terapêutica se baseou em técnicas broncoscópicas ou não.

Aspirado transtraqueal

Trata-se de uma técnica bastante utilizada na década de 70, mas que atualmente devido aos riscos que leva para o paciente (enfisema subcutâneo, estímulo vaso-vagal, hemoptise), está preterido em função do aparecimento de procedimentos mais promissores. Outro fato relevante é o elevado número de resultados falso-positivos, pelo isolamento de flora colonizadora do trato respiratório superior.



Lavado brônquico não dirigido

Método simples, de baixo custo e seguro recomendado para rotina de vigilância bacteriológica em pacientes ventilados mecanicamente.


No estudo que levou estas a conclusões, observou-se que durante dias anteriores ao paciente apresentar um quadro de pneumonia, havia aumento significativo de um número inferior ou igual a 103 UFC/ml para maiores ou iguais a 105 UFC/ml; ainda revelou queda do número de colônias em pacientes que responderam a antibioticoterapia, em contraste com aqueles que mostraram uma progressiva deterioração clínica, para os quais não existiu queda significativa na contagem de colônias.

Lavado bronco-alveolar e escovado bronco-alveolar

Das técnicas endoscópicas o lavado e o escovado bronco-alveolar são as mais utilizadas. O escovado bronco-alveolar obtém um maior volume de amostra, o que aumenta a sensibilidade do método e permite que se realize um maior número de procedimentos diagnósticos além da cultura, após a citocentrifugação da amostra. Dentre eles incluem-se colorações para identificação de organismos específicos, porcentagem de macrófagos e leucócitos contendo microrganismos (nas pneumonias considera-se relevante acima de 2%), e presença de fibras de elastina como indicador de necrose pulmonar.


São referidos valores de sensibilidade e especificidade para o lavado bronco-alveolar variando de 80-100% e 75-100% respectivamente e para o escovado de 65-100% e 60-100%.

Escovado protegido

O volume recuperado de secreção pulmonar por um escovado é aproximadamente de 0,001ml. O escovado é diluído em 1 ml de meio, resultando na diluição da bactéria em 100 a 1000 vezes. Portanto o crescimento de pelo menos 103 UFC/ml em placas indica uma concentração inicial de 105 a 106 bactérias na secreção pulmonar.



BAL ou lavado bronco-alveolar

No lavado bronco-alveolar recupera-se 5 a 10 vezes o volume de bactérias do escovado, visto que a diluição de 1 ml de secreção se faz em 10 a 100 ml de soro fisiológico, de forma que a contagem de 104 UFC/ml a partir do material recebido no laboratório, representa 105 a 106 UFC/ml na secreção pulmonar. Em pacientes com forte suspeita clínica de pneumonia, valores a partir 102-103 de cada agente isolado para escovado e 103-104 UFC/ml para o lavado podem também ser significativos; o uso de antimicrobianos estaria recomendado.



Biópsias

Podem ser feitas de formas variadas: percutânea, através de broncoscopia, por meio do fibroscópio, pela toracoscopia e a céu aberto. Indicado nos casos de imunocomprometidos e crianças com má evolução à terapêutica empírica.


Punção biópsia pulmonar - trata-se de um procedimento, que quando resulta em cultura positiva, é bastante fidedigno, já que os problemas com contaminação com a flora do trato respiratório superior inexistem. Os relatos da literatura revelam que em situações variadas, o diagnóstico etiológico das infecções, com esta técnica, ocorreu entre 30% a 82% dos casos estudados e falso-negativos de cerca de 18%. Complicações mais importantes são pneumotórax e sangramento em casuísticas que variam de 5 a 39%.
Biópsia transbrônquica - os resultados diagnósticos são semelhantes à punção pulmonar aspirativa, mas revelaram menor índices de complicações.
Biópsia pulmonar - a biópsia a céu aberto, método definitivo para o diagnóstico das pneumonias, é um procedimento pouco realizado. Está indicada em casos sem melhora clínica, em que não foi possível isolar o microrganismo por outras técnicas ou que há necessidade de diagnóstico específico com maior rapidez. Convém salientar que de nada adianta obter boas amostras para estudo microbiológico quando se emprega técnica laboratorial convencional, isto é, morosa e de baixa sensibilidade.

Toracoscopia

A toracoscopia tem sido pouco utilizada, embora resultados sejam muito favoráveis, com achados diagnósticos superiores a 90% e baixa taxa de complicações.



Derrame pleural

O derrame pleural costuma ocorrer, aproximadamente, em pneumonias causadas por Pneumococo 10%, Bacilos Gram negativos 50-70% e Streptococcus pyogenes (grupo A) 95%. Além da bacterioscopia, baciloscopia (Micobacterias) e culturas (bactéria, micobactérias, fungos), o material deverá ser reservado para estudo citológico e bioquímico para afastar outras causas de derrame com infiltrados pulmonares:



  • Infarto pulmonar

  • Insuficiência cardíaca

  • Tumor

  • Doenças do colágeno, etc.



Hemocultura

Através da hemocultura também pode se isolar o microrganismo de um processo respiratório considerando-se que isto ocorre entre 1 a 16 % dos casos, no entanto não deve ser utilizada de forma isolada para o diagnóstico de pneumonia. É altamente específico e é indicada em pacientes com pneumonia que necessita de hospitalização.



Contagens bacterianas significativas

O cálculo dos valores limítrofes para definição de infecção para amostras do trato respiratório, deriva da concentração de microrganismos encontrada em culturas do tecido pulmonar infectado. Comparando-se o número de bactérias na amostra, estima-se o número na secreção original. As infecções pulmonares clinicamente significativas contêm pelo menos 104 UFC/g de tecido.


Significado das contagens bacterianas em relação à amostra clínica


Material

Volume obtido

Fator de diluição

Valor significativo

Escarro, aspirado, endotraqueal, aspirado por broncoscopia

≥ 1 ml

1

105–106 UFC/ml

Escovado brônquico protegido

1 a 10 µl diluídos em 1ml

1/100 – 1/1000

103 UFC/ml

Lavado broncoalveolar (BAL)

1ml diluído em 10 a 100 ml

1/10 – 1/100

104 UFC/ml





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