Manual de procedimentos básicos em microbiologia



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Diagnóstico laboratorial



dados laboratoriais relevantes





  • Gram do sedimento pode revelar a etiologia: bacteriana, fúngica (fungos leveduriformes ou filamentosos), tendo uma sensibilidade de 60 a 90% e especificidade próxima de 100% quando realizada por profissionais bem treinados.

  • A positividade depende da concentração bacteriana, variando de 25% quando a concentração de UFC (unidades formadoras de colonias) for 103 ou menos, até 97% quando a concentração for igual ou superior a 105 UFC.

  • A positividade do Gram também varia conforme o agente etiológico, sendo de 90% para o pneumococo, 86% para o hemófilos, 75% para o meningococo, menos de 50% para Listeria monocytogenes e 50% para outros Gram negativos. A coloração de Gram não cora bactérias como os micoplasmas e, evidentemente, não detecta os vírus.

  • Chances de se obter informações sobre a etiologia pelo Gram ou pela cultura se reduzem a menos de 50% quando há uso prévio de antimicrobianos, podendo o LCR ficar estéril em 90-100% dos casos após 24 a 36 horas de antibioticoterapia adequada.

  • Tinta da china e calcofluor: detecta Cryptococcus ou presença de movimentos amebóides (amebas)

  • Coloração de Ziehl Neelsen e auramina: micobactérias

  • Aglutinação com partículas de látex (sensibilidade de 70 a 90%): existem testes disponíveis para detectar meningococo (A e C), hemófilos tipo B, pneumococo (polivalente), Streptococcus do grupo B, E. coli K1 e Cryptococcus spp. Alguns kits não incluem o meningococo B ou podem ter uma sensibilidade inferior para este antígeno. Existem também testes baseados em coaglutinação de Staphylococcus, que tem uma sensibilidade um pouco inferior à aglutinação pelo látex. Estes testes vem sendo cada vez menos utilizados pelo elevado custo.

  • Teste do Limulus pode ser utilizado para detectar endotoxina de bactérias Gram negativas, tendo alta sensibilidade e especificidade para concentrações ≥ 103 UFC/ml.

  • Cultura em Ágar chocolate pode confirmar a etiologia bacteriana e permitir o estudo das sensibilidades aos antimicrobianos.

  • Os vírus podem ser pesquisados por métodos diretos ou cultura para vírus com tipagem. A pesquisa monoclonal e o PCR representam os métodos de maior praticidade, especificidade e sensibildade que se dispõe na atualidade.



Processamento de amostras - LCR

Devido à importância vital do SNC, e, portanto, a gravidade do quadro clínico que acompanha a maioria das doenças e a urgência do diagnóstico em uma área topográfica estéril, a eficiência é um aspecto crítico (rapidez, testes adequados e cuidados para evitar contaminação). Obter qualquer amostra antes de iniciar uso de antimicrobianos.


LCR deve ter máxima prioridade devendo ser processado imediatamente. Avalie e anote o volume e o aspecto do LCR.
LCR por punção lombar ou de reservatório de próteses (vide técnica para coleta de LCR)
Coletar o segundo tubo, obtendo idealmente os seguintes volumes:

  • 1-2 ml para Gram, pesquisa de antígenos e cultura (na falta de plantão de microbiologia pode ser semeda a cultura [5 a 10 gotas] diretamente durante a punção para coleta do LCR, em tubos de ágar chocolate, previamente aquecidos a 35oC, preparados há menos de 30 dias); pode-se semear um tubo com ágar sangue (base Mueller Hinton ou Ágar brucella) e um tubo com caldo tioglicolato caso haja suspeita de anaeróbios

  • 2 ml para exame direto e cultura para fungos (se indicado)

  • 2 ml para coloração de Ziehl e cultura para micobactérias (se indicado)

  • 2-3 ml para provas virológicas (se indicado)


Exame da cultura


  • Durante 72 horas observe diariamente a presença de crescimento nas placas e tubos com ágar chocolate. Pode-se prolongar a incubação para o total de sete dias.

  • No tubo com caldo deve ser observada turvação diariamente e descartado após 7 dias. Caso haja crescimento, fazer um Gram e semear em placa de ágar chocolate para isolamento, identificação e antibiograma.

  • Em casos de hemófilos e neisserias fazer o teste da beta-lactamase com discos de nitrocefina (Cefinase)

  • Se positivo, comunicar o médico imediatamente.

  • Em caso de pneumococos, testar a penicilina usando discos de oxacilina 1 micrograma. Se halo para oxacilina ≥ 20mm, a cepa é sensível à penicilina. Halo ≤ 19 mm encaminhar a cepa a um Laboratório de Referência ou fazer teste da Concentração Inibitória Mínima (CIM), podendo ser usado o E-test:

  • Penicilina ≤ 0,06 microgramos/ml = cepa sensível

  • Penicilina 0,12 a 1 microgramos/ml = cepa de sensibilidade intermediaria.

  • Penicilina ≥ 2,0 microgramos/ml = cepa resistente


Interpretação do exame


  • Contagem de glóbulos brancos = > 1.200 mm3 sugere meningite bacteriana (valores menores não excluem).

  • Predomínio de mononucleares (< 50% de neutrófilos) sugere meninigite não bacteriana ou parcialmente tratada.

  • Glicose < 30 mg/100 ml sugere meningite bacteriana, por micobactéria ou fúngica.

  • Proteínas >150 mg/100 ml sugere meningite bacteriana.

  • Cloretos < 110 mEq/L sugere meningite por tuberculose se afastada outra etiologia bacteriana. Atualmente pouco utilizado devido a disponiblidade de testes mais específicos.

  • Lactato no LCR > 35 mg/100 ml é sugestivo de meningite bacteriana.



Pesquisa de antígenos

Pode detectar a presença de microrganismos, mesmo na vigência de antibioticoterapia. Os testes detectam polissacárides em suspensão, por isso deve-se usar o sobrenadante. Alguns testes solicitam prévia colocação da amostra para teste em banho-maria (fervente) por 5 minutos. Consulte e siga as orientações do produto adquirido.




  • Colocar as gotas de látex no cartão, orientando-se conforme a indicação de cada teste.

  • A seguir depositar uma gota do sobrenadante do LCR ao lado da gota de latex.

  • Usar um bastão ou alça flambada para cada teste.

  • Observar a aglutinação conforme padrão e no tempo descrito por cada fabricante.

Aglutinações que ocorrerem com mais de um anticorpo devem ser relatadas como indeterminadas ou não interpretável. Pode-se tentar diluir o LCR em salina 1:2 ou 1:4. Repetir os testes e observar os resultados.


Rotina de Plantão
Se não for possível encaminhar ao Laboratório de Microbiologia (plantão de fim de semana) ou porque sua rotina é lenta, o LCR deve ser processado pelo laboratório de urgência (plantão) ou por médicos ou analistas treinados para os seguintes procedimentos:


  • Colher 5 a 10 gotas do LCR diretamente da punção em 1 tubo de Ágar chocolate de preparação recente e previamente aquecido a 35oC ou:

  • Centrifugar 1 a 2mL do LCR entre 2.500 a 3.000 rpm, por 15 minutos.

  • Cuidadosamente, flambar a boca do tubo e em condições assépticas (fluxo laminar ou atrás de um bico de Bunsen), e, para os testes de aglutinação aspirar 0,5 a 1mL do sobrenadante com ponteira estéril (ou pipeta plástica estéril ou pipeta Pasteur com ponta fina de vidro, conectada a um bulbo de borracha ou pêra de aspiração). Deixar 0,5 a 1mL para cultura e Gram. Flambar novamente.

  • Agitar no vortex o tubo com o resto do sobrenadante e sedimento. Em condições assépticas (vide acima), semear 3-4 gotas do material em placa de ágar-chocolate e, se disponível, também em placa de ágar-sangue e em tubo com caldo tioglicolato sem indicador.

  • Colocar as placas e tubo na estufa entre 35 a 37oC, sendo a placa de Ágar chocolate em jarra com vela e umidade (CO2 e umidade).

  • Depositar 1 gota do material no centro de uma lâmina de vidro previamente desengordurada em álcool, para fazer o esfregaço.

  • no caso de amostras límpidas, pode-se depositar duas gotas e fazer esfregaço menos extenso, quando mais purulento, fazer esfregaço mais espalhado.

  • deixar secar e fixar rapidamente no calor

  • fazer a coloração de Gram e anotar o resultado



Processamento de amostras – Abcesso cerebral



Abscesso Cerebral (vide técnica para coleta de material)


  • Obter o material por punção e aspiração, mantendo-o na seringa para ser enviado ao laboratório. Como a participação de anaeróbios é importante, o material deve ser colhido em frascos com vácuo ou na própria seringa.

  • Manipular material de SNC com luvas, evitar aerossol e encaminhar o mais rápido possível ao laboratório. Amostras para virologia devem ser encaminhadas ao laboratório rapidamente à temperatura ambiente. As pesquisas monoclonais de vírus exigem que as células estejam íntegras. Apenas material para investigações futuras e pesquisas por métodos moleculares de agentes RNA deve ser obrigatoriamente conservado entre -20 a -70oC.


Amostras de aspirado de abscesso e de material obtido em cirurgia ou em necropsia:

  • Semear em placa de ágar chocolate e incubar em jarra com vela a 35oC.

  • Semear em placa com ágar brucella e suplementos hemina e vitamina K para cultura de anaeróbios em jarra apropriada com gerador de anaerobiose a 35oC.

  • Semear em placa de ágar sangue em estufa a 35oC.

  • Semear em tubo de caldo tioglicolato a 35oC.

  • Fazer esfregaço, fixar e corar pelo Gram. Reservar o resto do material.

  • Caso o Gram revele:

  • diplococos Gram negativos: sugestivo de Neisseria spp.

  • cocos Gram positivos em cachos agrupados: Staphylococcus aureus (ou coagulase neg.)

  • cocos Gram positivos em cadeias longas ou aos pares: Streptococcus (S. pneumoniae ou outros estreptococos aeróbios ou anaeróbios)

  • bacilos Gram positivos: Listeria spp., Corynebacterium spp. (contaminante ou em derivações), esporulados (Bacillus ou Clostridium).

  • suspeita de bacilo da tuberculose: fazer coloração de Ziehl-Neelsen ou auramina e se confirmado, semear em Lowenstein Jensen ou outro meio especifico.

  • ramificados: Actinomyces ou Nocardia (fazer Ziehl Neelsen)

  • cocobacilo Gram negativo: hemófilos, Brucella, Pasteurella sp, etc.

  • Acinetobacter spp. (Infecção Hospitalar (IH) em derivações e próteses do SNC)

  • bacilo Gram negativo: enterobactérias, Pseudomonas spp. (IH)

  • Fungos: leveduriformes ou dimórficos.

Candida - exame direto com Lactofenol e semear em ágar Sabouraud dextrose (ASD)

Cryptococcus spp. - tinta da china para melhor caracterização; semear em BHI ágar

Histoplasma capsulatum - semear em BHI, ágar glutamina

Filamentosos e oportunistas em geral - semear em ASD





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