Manual de procedimentos básicos em microbiologia



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Diagnóstico Laboratorial




  • Uma história de emprego recente de antibioticoterapia prolongada deve ser considerada para direcionar a pesquisa de toxina de Clostridium difficile como uma das etiologias. Outras possibilidades são o S. aureus, Candida spp. e P. aeruginosa.

  • Os antibióticos mais frequentemente associados à diarréia por C. difficile são: cefalosporinas, ampicilina, amoxicilina, outros derivados de penicilinas, macrolídeos, tetraciclinas e sulfazotrim.

  • Quando possível selecionar porções de fezes contendo muco, e/ou sangue e/ou pús.

  • A pesquisa de eosinófilos no muco positiva é sugestiva de diarréia de causa alérgica.

  • Diarréia por toxina tem curta duração, pesquisa de leucócitos, sangue e presença de muco negativa. Diagnóstico laboratorial difícil, pois o agente costuma não estar presente.

  • Para cultura de Campylobacter há necessidade de meio de cultura específico.

  • Pesquisa de leucócitos e eosinófilos: deve-se enviar fezes frescas para exame (não swab) ou em meio de transporte.



Meios de transporte





  • Salina glicerinada e tamponada é indicada para Salmonella e Shigella.

  • Cary Blair é indicado para todos os patógenos bacterianos intestinais, exceto Shigella. No caso do Clostridium difficile, as fezes devem ser congeladas a menos 20oC ou submetidas ao teste rapidamente.

  • Fezes e aspirados gastrointestinais podem ser transportados sob refrigeração em frascos estéreis, e biópsias podem ser conservadas com um pouco de salina em frasco estéril. Em geral o meio de transporte inviabiliza a pesquisa de leucócitos nas fezes, sugestivo de agente invasor.

  • Materiais inapropriados para processamento: fezes ou material do trato digestivo transportado a temperatura ambiente sem meio de transporte, swab seco ou sem sinais de fezes, biópsias secas.

Quando não houver informações clínicas ou pedido específico, a rotina recomendada é a pesquisa dos seguintes agentes:




  • Salmonella, Shigella, Aeromonas, Plesiomonas, Yersinia: podem ser isolados em Mac Conkey e Salmonella-Shigella. Recomenda-se também incluir a cultura para Campylobacter, que exige meio específico. No caso de fezes com sangue, pesquisar EHEC.

  • Em coprocultura de crianças até 1 ano considera-se rotina a pesquisa de Salmonella, Shigella, EPEC, (E. coli enteropatogênica), EIEC (E. coli enteroinvasora) e EHEC (E. coli entero-hemorrágica). Deve-se incluir também a pesquisa de Yersinia enterocolítica, Aeromonas e Plesiomonas.



Características de alguns meios sólidos





  • Ágar Mac Conkey e Ágar Eosin Metilene Blue (EMB) são meios diferenciais, mas não seletivos entre os Gram negativos entéricos.

  • O Ágar Salmonella-Shigella funciona bem para para as Salmonella mas pode inibir Shigella.

  • O Ágar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) é recomendado para Salmonella e Shigella, mesmo as mais exigentes.

  • Ágar Hektoen entérico (HE) é adequado para Salmonella e Shigella

  • Ágar verde brilhante (VB) é seletivo para Salmonella sp, mas não é indicado para Salmonella typhi e S. paratyphi.

  • Ágar sulfito de bismuto (Wilson & Blair) é seletivo para Salmonella.


Caldos de enriquecimento:
Indicado para detectar baixo número de Salmonella ou Campylobacter em portadores. Muitos laboratórios estão abandonando o uso de caldos de enriquecimento pela baixa recuperação de patógenos.

Caldo GN (Gram Negativo) - enriquecimento de Salmonella e Shigella spp Caldo Selenito F - principalmente Salmonella spp Caldo tetrationato - apenas algumas especies de Salmonella spp e exclui S. typhi.

Campy-tioglicolato - apenas para pesquisa de portadores de C. jejuni Salina fosfatada e tamponada pH 7,6 - para semear fezes e conservar em geladeira por três semanas para pesquisa de portadores de Yersinia enterocolitica, mas não indicado para rotina.


RELATÓRIO DE RESULTADOS


Com o reconhecimento do número crescente de agentes bacterianos causadores de diarréia, tornou-se importante a identificação específica de microrganismos para o qual as amostras fecais são examinadas.




  • É incorreto emitir o resultado como “não foram isolados patógenos”, se as fezes foram cultivadas somente para recuperar alguns patógenos. Ao invés disso o relatório deve afirmar “não foram isoladas Salmonella, Shigella e Campylobacter” ou para algum outro patógeno efetivamente pesquisado.

  • O protocolo deverá prever também laudos relatando a ausência da flora fecal Gram negativa e a presença de quantidade significativa de microrganismos como S. aureus, leveduras e Pseudomonas aeruginosa.

  • Se as amostras fecais ou as cepas isoladas forem enviadas ao Laboratório de Referência para trabalho posterior, tais como pesquisa da presença de toxina de C. difficile ou sorotipagem de cepas de Salmonella, o relatório para os referidos exames deve incluir o nome do laboratório de referência e as provas realizadas (sorotipagem determinação das toxinas, etc.)


Procedimentos Gerais para o Isolamento dos principais Agentes Bacterianos de Infecção Intestinal


Microrganismo

Mecanismo de Patogenicidade

Técnica

Enriquecimento

Meios de cultura

Campylobacter, C. jejuni

Invasão


Culturas incubadas em ambiente de microaerofilia à 42ºC.


não


Ágar p/ Campylobacter com suplementos de antibióticos como o meio de Skirrow, Campy-BAP(Blaser), etc.

Escherichia coli Enteropatogênica, E. coli Invasora

Enterotoxinas (LT e ST) - Invasão

24-48 h aerobiose, 35-37oC.

Não

Ágar Mac Conkey ou Ágar eosina azul de metileno.

E. coli enterohemorrágica O157:H7 e outras

Verotoxinas (toxina Shiga-like)

24-48h aerobiose, 35-37oC.

não


Ágar diferencial: Ágar Mac Conkey sorbitol (SMAC) ou Ágar Mac Conkey

Salmonella spp.

Invasão

24-48h aerobiose, 35-37oC.

Selenito F *, Caldo tetrationato *, Caldo GN *.

Ágar Salmonella-Shigella, Mac Conkey ou Ágar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) ou Ágar Hektoen enterico (HE)

Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus

Toxina colérica Toxinas

24-48h aerobiose, 35-37oC.

Água peptonada alcalina por 6-12 h.

Ágar TCBS, cresce em Mac Conkey.

Yersinia enterocolitica

Invasão





Salina glicerinada tamponada à 4-5ºC por três semanas, não recomendado.

Ágar Salmonella-Shigella, Ágar Mac Conkey e meio seletivo: Ágar cefsulodina- irgasan-novobiocina


* atualmente questiona-se a necessidade do uso de caldos de enriquecimento, ficando a critério de cada usuário.





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