JOSÉ artur zanluti filho prevalência de staphylococcus sp. Em populaçÕes humanas distintas: avaliçÃo de sensibilidade a antimicrobianos e produçÃo de proteases puc pr Curitiba – 2012 jOSÉ artur zanluti filho prevalência de staphylococcus



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jOSÉ aRTUR zANLUTI fILHO


PREVALÊNCIA DE STAPHYLOCOCCUS sp. EM 3 POPULAÇÕES HUMANAS DISTINTAS: AVALIÇÃO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS E PRODUÇÃO DE PROTEASES


PUC Pr

Curitiba – 2012

jOSÉ aRTUR zANLUTI fILHO

PREVALÊNCIA DE STAPHYLOCOCCUS sp. EM 3 POPULAÇÕES HUMANAS DISTINTAS: AVALIÇÃO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS E PRODUÇÃO DE PROTEASE
Trabalho apresentado ao Programa de

Pós-Graduação em Microbiologia da

Pontifícia Universidade Católica do

Paraná.


Orientador(a): Prof. Dr. Luiz F. Caron

PUC - Pr

Curitiba – 2011
RESUMO
Os seres humanos convivem com as bactérias desde o princípio da evolução em busca de equilíbrio. Com o passar dos anos o homem vem colocando em seu habitat uma quantidade cada vez maior de antibióticos, seja para curar ou prevenir doenças ou ainda para produzir alimentos. Até onde essa atitude pode influenciar a microbiota normal do homem, até que ponto essa pode se tornar resistente a antibióticos e passar a causar doenças? Para responder essas questões foi pesquisada a presença Staphylococcus sp. de na microbiota nasal de pessoas que trabalham em diferentes ambientes (comunidade, saúde, granja de aves), e ainda, se há diferença no seu comportamento frente a antibióticos e qual porcentagem produz proteases. Os achados mostraram diferenças entre pessoas que trabalham na saúde, granjas e comunidade em relação a presença das bactérias estudadas na região de mucosa nasal, 22%, 15% e 17% respectivamente e ainda apresentam diferentes perfis de resistência no antibiograma, tendo o grupo saúde e granja apresentado maior resistência proporcional, 44,2 %e 55,5% em relação ao grupo comunidade 35,6%. Na produção de protease igualmente o grupo saúde e granja apresentou maior produção 35% para ambos, em relação ao grupo comunidade, 12% nesse caso mais que o dobro dos valores.

Palavras chave: bactérias, antibióticos, mucosa, proteases.



ABSTRACT

Human beings coexist with bacteria since the beginning of evolution, always in a search for balance. Over the years man has been introducing into his natural habitat an increasing amount of antibiotics, either to cure or prevent diseases or to produce food.

How far this attitude may influence the normal flora of man? To what extent those bacteria may become resistant to antibiotics and start to cause diseases? To answer these questions we have investigated the presence of coagulase positive Staphylococcus on the nasal flora of people who work in different environments like. The community in general, health services and poultry farms, we also measured the differences in their reaction regarding antibiotics and what percentage produces proteases. The findings showed differences between people working in health and community farms for the presence of bacteria in the studied region of the nasal mucosa, 22%, 15% and 17% respectively and also have different resistance profiles in the antibiogram, with group health and farm had a greater resistance proportional 44.2% and 55.5% compared to the community group 35.6%. In the production of protease also the group health and farm produced most 35% for both, compared to group community, 12% in this case more than double the values.
    
Keywords: bacteria, antibiotics, mucus, protease.
INTRODUÇÃO

O termo microbiota normal trata das colonizações de micro-organismos, outrora chamado de flora microbiana, que habitam a pele e as mucosas de pessoas sadias.

Pele e mucosas sempre abrigaram uma variedade de micro-organismos que podem ser classificados em dois grupos: flora residente, composta por tipos relativamente fixos de microorganismos em determinados locais, que quando perturbada se reestrutura rapidamente, e flora transitória, formada por micro-organismos não patogênicos ou potencialmente patogênicos, os quais permanecem por tempo determinado, vindos do meio ambiente. A flora residente também chamada de comensal, que literalmente significa “organismos que se alimentam juntos”. Exceto por invasores temporários ocasionais, os órgãos e sistemas internos são estéreis (9,11,12). Os locais mais comuns do corpo humano que são habitados por esses micro-organismos da microbiota normal, como esperado, são aqueles em contato ou em comunicação com o meio externo, como a pele, os olhos, o trato respiratório superior, o trato gastrintestinal e o trato urogenital (6,11,12). As espécies que compõe a microbiota normal não podem ser definidas com rigor para todos os seres humanos, pois variam de indivíduo para indivíduo devido a diferenças fisiológicas, dieta, idade, e hábitat (9,10,11).

Com o passar do tempo o homem vem colocando em seu habitat uma quantidade cada vez maior de antibióticos seja para cura de doenças ou para prevenção delas e ainda para melhor produção de alimentos onde são usando-os como melhoradores de desempenho (12). Essa disseminação no meio teria capacidade de influenciar a microbiota normal do ser humano tanto em espécie de micro-organismos quanto seu comportamento frente a medicamentos comuns em seu combate? O reflexo desta dúvida tem sido observado pelas pressões da comunidade internacional em relação a produção de alimentos, especialmente a produção de aves e suínos, onde os antibióticos tiveram e ainda tem grande importância como melhoradores de desempenho . Como a convivência contígua e constante entre o homem e os animais é cada vez mais freqüente, há uma grande preocupação com enfermidades emergentes e re-emergentes advindas desta condição. Este ramo da ciência tem sido chamado de medicina da conservação, onde a saúde do homem, dos animais e do ambiente deve ser avaliada e garantida para se evitar a emergência dos possíveis problemas.(4,5)

A importância epidemiológica dos portadores de micro-organismos patogênicos em microbiota normal tem sido constante motivo de preocupação, visto que essa vem sendo associada com cada vez mais freqüência a enfermidades que acometem a população (16,18). Talvez o exemplo mais dramático desta situação tenha sido a ocorrência da influenza aviária, ou gripe do frango que inicialmente em 1997 surgiu como emergência sanitária e desde 2006 se espalhou pelo mundo iniciando pelo sul da Ásia além de alguns países da Europa. O interessante foi a relação observada em estudos entre a ocorrência de algumas bactérias saprófitas em suínos e aves, que são produtoras de proteases, entre elas o Staphylococcus coagulase positiva, e por isso facilitam a adsorção do vírus da influenza que deve ser clivado por proteases do organismo do hospedeiro no momento da infecção. A conclusão destes estudos é de que o aumento da prevalência e a ocorrência desses micro-organismos, coincide com a pressão pela retirada de antibióticos da alimentação animal em 2006 por parte dos países importadores. Isso resultou em um incremento na presença destas bactérias na microbiota normal desses animais, e consequentemente num incremento na presença de proteases bacterianas, e coincidentemente houve nesse período um aumento na incidência do vírus da influenza, uma facilitação na infecção e a evolução rápida destes vírus como se tem observado nos últimos cinco anos (4,11,21).

O presente trabalho tem o objetivo de avaliar, através da comparação de grupos de pessoas, se nosso habitat exerce influencia sobre a composição da microbiota normal, bem como o comportamento da mesma frente a antibióticos e a capacidade das cepas para a produção de proteases bacterianas. Será avaliado se o Staphylococcus coagulase positiva residente na microbiota da mucosa nasal, sofrera influência do meio em que vivem as pessoas e da atividade que elas exercem , no que se refere a presença no hospedeiro e no seu comportamento frente a antibióticos de maior uso em seu combate . Ainda será avaliada a capacidade do Staphylococcus sp. em produzir proteases.


METODOLOGIA
As amostras: foram colhidas da mucosa nasal de 3 grupos de pessoas composta por 40 indivíduos cada, selecionados aleatoriamente: Grupo Comunidade composto por 40 indivíduos da sociedade, Grupo Saúde composto por 40 indivíduos que trabalham em hospitais e laboratórios da análises clínicas e Grupo Granja composto por 40 indivíduos que trabalham em aviários. Critérios a aceitação de pessoas: Grupo Comunidade: nunca ter trabalhado na área de saúde ou aviários, não ter sido internado em hospital nos últimos 30 dias, não ter feito uso de antibióticos nos últimos 30 dias. Grupo Saúde: estar trabalhando há mais de um ano na atividade, não ter sido internado em hospital nos últimos 30 dias, não ter feito uso de antibióticos nos últimos 30 dias. Grupo Granja: nunca ter trabalhado na área de saúde, não ter sido internado em hospital nos últimos 30 dias, não ter feito uso de antibióticos nos últimos 30 dias. Estes grupos foram formados por habitantes da cidade da Lapa – PR entre os meses de janeiro e novembro de 2011.

Coleta: as amostras foram coletadas da mucosa de apenas uma fossa nasal de cada indivíduo, por padronização a esquerda, usando swab estéril e colocadas imediatamente em meio de enriquecimento BHI (Laborclin) após a coleta. No laboratório foram semeadas por esgotamento em agar sangue (Laborclin) e incubadas por 24h a 35° C em estufa bacteriológica. (7,22,23)

Identificação: as colônias foram submetidas a coloração de GRAM, os cocos testados para prova da catalase em lâmina e coagulase (Laborclin) em tubo .(9)

Antibiograma: somente os cocos coagulase positiva foram testados. Se utilizou o método de agar difusão (Kirby-Bauer) onde o inoculo foi preparado com a colônia a ser testada diluída em salina estéril, de modo a corresponder a 0,5 da escala McFarland, passado em agar Mueller-Hinton (Laborclin) onde foram colocados discos de cefoxitina, amoxicilina, cefalotina, norfloxacina, lincomicina, sulfa + trimetopima e oxacilina. Após incubação de 24hs a 35° C foi realizada a leitura dos antibiogramas. (1,2,10).

Prova da caseína: em paralelo foi preparada solução usando a mesma metodologia da escala McFarland para todas as colônias tanto cogulase positiva quanto as negativas que foram inoculadas em agar caseína para avaliar (o consumo da mesma pelas bactérias testadas, e a conseqüente) a produção de proteases. Após incubadas 24hs a 35 °C em estufa bacteriológica a cultura foi revelada com borrifos de ácido acético a 3% no meio de cultura, sendo considerado positivo qualquer clareamento do meio ao redor do local de deposição do inoculo.(10,12)
RESULTADOS E DISCUSSÃO

As amostras obtidas em todos os grupos mostram uma prevalência do Staphylococcus coagulase negativa, sendo obtido os resultados de 78%, 82% e 85% nos grupos saúde, comunidade e granja respectivamente. Quanto a coagulase positiva se observou uma maior presença no grupo saúde com 22%, contra 17,5% do grupo comunidade e 15% do grupo granja. (Gráfico I).



Gráfico I: Prevalência de Staphylococcus coagulase positiva/ negativa


Vanzo (20) em estudo achou 20% de Staphylococcus coagulase positiva em um total de 67 manipuladores de alimentos valor aproximado aos encontrados no grupo comunidade deste estudo, Lamikanra (11), em estudo realizado com 548 estudantes nigerianos encontro uma prevalência de 21,5% para portadores de Staphylococcus coagulase positiva. No grupo saúde, Santos (17) em estudo com 42 auxiliares de enfermagem obteve prevalência de 26,7% para Staphylococcus coagulase positiva e Heshiki (9) em estudo com 73 enfermeiros obteve 21,5% de prevalência para Staphylococcus coagulase positiva. Os valores encontrados no grupo granja são considerados inéditos, devido a falta de referências sobre o assunto a nível mundial o que impossibilitou a realização de fundamentação baseada em outros autores. Fica assim como material comparativo para futuras pesquisas.


Em relação ao resultado do antibiograma, as bactérias do grupo saúde apresentam 44,4% de resistência aos antibióticos testados, o grupo granja 55,5% e o grupo comunidade 35,6% representados na (tabela I).

Tabela I: Antibiograma nos grupos.

O Staphylococcus coagulase positiva possui grande capacidade de adquirir resistência a antibióticos, essa capacidade vem da rapidez com que tal bactéria se reproduz e do uso indiscriminado e muitas vezes sem critérios de drogas usadas em seu combate.(14,15,16). Comparativamente com Farias (4) e Martinez (14) em estudos com população semelhante, tanto em atividade ocupacional, quanto em número de amostra o grupo comunidade e saúde apresentam achados semelhantes, por outro lado Menegotto e colaboradores (15) apresentaram resultados discordantes no que se refere a oxacilina que teve 100% de sensibilidade em todos os grupos desse estudo e no do referido autor apresentou uma resistência de 15,5%. Provavelmente essa diferença se explique pelo (n) de 1500 indivíduos do estudo. Os resultados do grupo granja devido a falta de trabalhos de mesmo conteúdo, fica sem comparativos, valendo ressaltar que os valores obtidos foram muito semelhantes aos do grupo comunidade. Quando comparamos os 22 antibiogramas realizados para observar o comportamento da bactéria de uma forma geral em todos os grupos obtemos os resultados expressos no (gráfico II).
Gráfico II: Sensibilidade e resistência em todas as amostras.

Todas as amostras mostraram-se sensíveis a Vancomicina, Cefalexina e Oxacilina. A literatura atual (8,10,14,16), cita resultados de vários trabalhos que compactuam com os dados achados, sendo proveniente destacar a baixa prevalência dos resultados intermediários presentes, isso possibilita uma grande facilidade na escolha do antibiótico a ser empregado no combate de bactéria estudada.(5,7)

Quanto a produção de protease nos grupos foram obtido os resultados expressos no (gráficoIII).

Gráfico III . Produção de proteases nos grupos.

Pode-se observar que tanto o grupo saúde quanto o granja tiveram mais que o dobro de produtores de protease que o grupo comunidade, como relatado anteriormente. A falta de trabalhos relacionados faz com que somente divulguemos os achados da pesquisa realizada.


CONCLUSÃO

O Staphylococcus coagulase positiva é um dos agentes patogênicos que tem sido indicado como o principal causador de doenças em pessoas de várias atividades ocupacionais, bem como em pacientes internados e ou debilitados seja por tratamentos, idade ou processos invasivos, ainda são comuns na flora normal de mãos e mucosas de manipuladores de alimentos, medicamentos e outros. (17,19,20)

Os resultados obtidos mostram que as pessoas que formam os grupos de trabalhadores da saúde e granja desse estudo, apresentam diferenças tanto na quantidade de Staphylococcus coagulase positiva, presente na flora normal, como no seu comportamento frete a antibióticos, e mais ainda no que se refere a produção de protease bacteriana. Foram apresentados resultados que nos mostram que o meio em que vivem e trabalham as pessoas que compõe os grupos estudados desse trabalho, podem vir a afetar a microbiota normal da mucosa nasal. Agora; o que fazer com indivíduos que apresentam estas bactérias? Devem ser tratados de maneira profilática? Será que os benefícios na retirada dos antibióticos da alimentação animal, compensam os riscos de pandemias como a do H1N1, visto que esse é um vírus com alta taxa de mutação, onde a protease do meio onde vivem facilita a sua adsorção pelas células dando maior condição para este se replicar a adquirir maior virulência.(12,13)

Essas são perguntas que ficarão para serem respondidas por pesquisas futuras.




ENTIDADES ENVOLVIDAS
Laboratório Becker de Análises e Pesquisas Clínicas. www.labbecker.com.br

Laborclin Produtos para Laboratórios. www.laborclin.com.br


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