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V. Discussão

A lamotrigina é um antiepiléptico de nova geração que apresenta um vasto espectro de eficácia, sendo bem tolerada pelos doentes. Todavia, os benefícios resultantes da sua administração deverão ser sujeitos a uma avaliação mais rigorosa, dado observar-se uma considerável variabilidade interindividual na dose requerida para obter uma adequada resposta terapêutica. À luz dos conhecimentos actuais, possíveis fontes de variabilidade poderão residir na transposição da barreira sangue (plasma)/cérebro ou na variabilidade intrínseca associada ao seu mecanismo de acção (Messenheimer, 1995).

Embora os dados experimentais e clínicos sugiram a existência de uma relação linear entre as doses de lamotrigina administrada e as respectivas concentrações plasmáticas obtidas, não foi ainda possível proceder ao estabelecimento de uma relação bem definida entre os níveis plasmáticos e a resposta farmacológica suscitada (Goa, Ross e Chrisp,1993; Fitton e Goa, 1995; Gilman, 1995; Messenheimer, 1995).

Como todos os antiepilépticos, a lamotrigina necessita de atravessar a barreira hematoencefálica e atingir o sistema nervoso central para exercer o seu efeito terapêutico (Löscher e Potschka, 2002), havendo a necessidade de se conhecer a relação entre os níveis plasmáticos e os níveis cerebrais deste antiepiléptico de nova geração, para que a interpretação dos níveis plasmáticos da lamotrigina possam reflectir as concentrações deste fármaco nos locais neuronais de acção (na biofase). Assim, após a caracterização neurofarmacocinética da lamotrigina em ratos (Castel-Branco, 2002; Castel-Branco et al., 2002b) e entrando em linha de conta com o facto de que a relação entre os níveis plasmáticos atingidos e a resposta farmacológica induzida permanece desconhecida, o objectivo a que nos propusemos foi proceder à caracterização do perfil anticonvulsivante da lamotrigina, correlacionar este perfil com os perfis previamente estabelecidos (modelização farmacodinâmica) e, posteriormente, proceder à avaliação e quantificação da sua potência anticonvulsivante através da determinação do ED50 (dose susceptível de proteger 50% dos animais da experiência). Após consulta bibliográfica, este trabalho parece constituir a primeira tentativa de relacionar os perfis cinéticos plasmáticos e cerebrais da lamotrigina com o seu perfil anticonvulsivante, avaliado através do teste do electrochoque máximo.

Depois da pesquisa bibliográfica exaustiva dos vários métodos disponíveis para induzir experimentalmente o complexo fenómeno que é a epilepsia, devidamente referenciados na Introdução e Apêndice desta memória, optámos pelo teste do electrochoque máximo. Esta escolha não foi fácil, atendendo a que o modelo a ser seleccionado teria que respeitar, por um lado, o compromisso entre as características de um modelo ideal, referidas a quando da Introdução a esta memória e, por outro, a necessidade de ser um modelo largamente validado e que pudesse ser tecnicamente exequível com os meios ao nosso dispor (Löscher e Schmidt, 1988).

Somos da opinião que este modelo experimental satisfaz os requisitos anteriormente mencionados. É, desde o seu aparecimento e desenvolvimento levado a cabo por Toman, Swinyard e Goodman (1946), um teste padrão no “screening” de potenciais novos antiepilépticos, continuando até aos nossos dias a ser considerado um dos primeiros testes a que se deve submeter, em animais normais, qualquer potencial antiepiléptico; é um teste rápido, simples de executar, económico e em que quase todos os fármacos antiepilépticos standard e os de nova geração são efectivos; o end-point escolhido (abolição da extensão tónica dos membros posteriores) é facilmente reconhecido e verifica-se uma elevada correlação entre a capacidade do fármaco inibir a extensão tónica em roedores (principalmente ratos e murganhos) suscitada no teste do electrochoque máximo e a sua eficácia clínica em crises generalizadas tónico-clónicas; permite que a capacidade do cérebro em manter uma “convulsão máxima” seja estudada, independentemente do limiar para as crises mínimas; apenas um electrochoque é aplicado por animal e por determinação, eliminando deste modo o efeito de choques subconvulsivos ou alterações devidas a convulsões mínimas não reconhecidas (Toman, Swinyard e Goodman, 1946; Browning e Nelson, 1985; Swinyard e Kuperberg, 1985; Löscher, Fassbender e Nolting, 1990; Löscher e Wauquier, 1996; Löscher, 2002a).

Da recolha bibliográfica efectuada facilmente se constata que diferentes investigadores, usando procedimentos aparentemente normalizados como seja o uso das mesmas espécies animais e idênticas doses de fármacos, apresentam resultados diferentes, o que leva a crer na existência de diversos factores técnicos, biológicos e farmacológicos condicionantes dos resultados experimentais. Assim, atendendo a que na literatura já estão referidos factores relacionados com os animais a utilizar como seja a idade, o sexo, a estirpe; as condições ambientais de alojamento como seja: temperatura e, humidade; a dieta a que são submetidos, o seu ritmo circadiano, alterações sazonais, natureza da formulação e do veículo a utilizar na dissolução do fármaco, características do estímulo eléctrico, equipamento,…. (Löscher, Fassbender e Nolting, 1991; Löscher e Fiedler, 2000; Löscher, 2002a), tentámos optimizar uma técnica experimental, entrando em linha de conta com a maioria destes factores.

Selecção dos animais de experimentação


Neste estudo toda a experimentação animal foi conduzida de acordo com as directivas da União Europeia e o projecto foi previamente aprovado pela Direcção Geral de Veterinária Portuguesa.

Das diversas espécies animais, os ratos e os murganhos são as espécies mais utilizadas nos estudos laboratoriais, envolvendo antiepilépticos. Todavia, Löscher e Schmidt (1988) defenderam que as doses activas dos fármacos anticonvulsivantes nos ratos, reflectiam melhor a sua potência clínica nos humanos, do que os murganhos. Por outro lado, Laffan, Swinyard e Goodman (1957) referiram que entre os ratos existe uma menor percentagem de não-extensores o que, como veremos posteriormente, é vantajoso no teste do electrochoque máximo. Face a estes factos, em todas as etapas do protocolo experimental foram utilizados ratos Wistar com idade superior a 6 semanas e com peso compreendido entre os 250 e 320g, ficando dessa forma assegurada a maturação de todos os sistemas biológicos do animal. Em vários trabalhos experimentais, Löscher e colaboradores (Löscher, Nolting e Fassbender, 1990; Löscher, Fassbender e Nolting, 1991) defenderam a utilização de fêmeas já que, em estudos de avaliação de potência, estas permitem uma eliminação mais rápida. No nosso caso optámos por ratos machos, preferindo-os às fêmeas, com o objectivo de evitar a eventual interferência do período de alterações endócrinas na excitabilidade cerebral (Swinyard e Kupferberg, 1985).

Os animais, após a sua chegada, foram sujeitos a um período de quarentena, finda a qual foram imediatamente manipulados; tiveram livre acesso à comida e à água e foram mantidos a uma temperatura constante de 21±2º C, uma vez que alterações ambientais bruscas podem causar alterações temporárias no limiar de excitabilidade (Woodbury e Davenport, 1952). De referir que, a presença de alimentos não interfere com a absorção da lamotrigina (Cohen et al.,1987) para além de que uma subalimentação poderá induzir o prolongamento da componente extensora da fase tónica e redução do limiar de excitabilidade, ou seja, poderá induzir o aumento da severidade da crise suscitada no teste do electrochoque máximo (Swinyard, Brown e Goodman, 1952). Só no momento da experimentação foi retirada, por breves instantes, a comida e a água. Este ponto também é importante já que, caso a comida e a água lhe fossem retiradas abruptamente, os animais tornam-se-iam agressivos e difíceis de manipular alterando, consequentemente, o limiar de excitabilidade, que se pretende manter estável durante todas as manipulações desde o teste em branco (Woodbury e Davenport, 1952).

Cada animal foi testado uma única vez, dado que a frequente indução de crises provoca uma elevação artificial do limiar de excitabilidade (Woodbury e Davenport, 1952). Todas as manipulações tiveram que ser rápidas de modo a provocar apenas uma perturbação mínima no dia a dia destes animais. Tentou-se evitar a interferência do ritmo circadiano e, deste modo, todas as manipulações foram realizadas no período da manhã.


Uma gota de anestésico (cloridrato de oxibuprocaína) foi colocada no saco conjuntival de todos os animais imediatamente antes da introdução dos eléctrodos corneais, garantindo um adequado estado de anestesia e contacto eléctrico, uma vez tratar-se de uma solução salina.

Selecção do aparelho de electrochoque


O equipamento utilizado para a aplicação do teste do electrochoque máximo deve assegurar a aplicação de um estímulo constante que não sofra influência da impedância inerente a cada animal. Assim, um ponto a ter em consideração na aplicação do teste é a resistência interna do estimulador, que deverá ser escolhida em função da resistência externa do animal. Normalmente essa resistência é de 5 k, pelo que se costuma seleccionar uma resistência interna de 10 k para o estimulador. Para além disso, um estimulador de corrente constante deve ser capaz de fazer um auto-ajuste da voltagem de modo a assegurar a aplicação do estímulo com a corrente efectivamente seleccionada (Löscher e Schmidt, 1988; Löscher, Fassbender e Nolting, 1991). O estimulador utilizado (Ugo Basile ECT unit 7801) baseia o seu princípio de funcionamento no desenvolvido por Woodbury e Davenport (1952) e foi devidamente regulado a fim de se respeitarem as exigências referenciadas.
Intensidade e duração do estímulo eléctrico

Desde que o teste do electrochoque máximo foi criado e desenvolvido por Toman, Swinyard e Goodman (1946), que a intensidade de 150mA foi sempre usada como intensidade padrão. Efectivamente, aqueles autores confirmaram que as crises induzidas por um estímulo eléctrico de intensidade de 150mA, duração de 0,2s e frequência de 60Hz são “máximas” e, em geral, “incrementos” na intensidade da corrente não alteram o padrão ou a duração da crise convulsiva em ratos. Tedeschi, Swinyard e Goodman (1946), bem como Laffan, Swinyard e Goodman (1957), chegaram às mesmas conclusões, pois, embora o aumento da intensidade da corrente se possa traduzir por ligeiras alterações nas componentes da fase tónica, ou seja, diminuir o período de flexão e aumentar o período de extensão, a duração total da crise não se altera já aquelas duas componentes se relacionam reciprocamente. Zablocka e Esplin (1964), também estudaram qual era o efeito (ou seja, se se verificava o aumento ou diminuição da percentagem de ratos extensores) obtido caso se procedesse ao aumento da intensidade da corrente de 150mA para 500 mA e os resultados que obtiveram não foram animadores.

A duração da estimulação, inicialmente proposta e utilizada por Toman Swinyard e Goodman (1946) e posteriormente por outros cientistas, foi de 0,2s. Todavia, Zablocka e Esplin (1964) e Browning e Nelson (1985), nos seus trabalhos, constataram que estímulos de longa duração são mais efectivos em activar as descargas paroxísticas do que os estímulos de curta duração. Face a estes dados preliminares, tentámos verificar qual o resultado obtido se se aumentasse a duração de 0,2s para 0,5s. A percentagem de ratos extensores aumentou consideravelmente; a maioria deixou de manifestar a componente clónica das crises e um não conseguiu recuperar, acabando por morrer. Perante este último facto optámos por seleccionar uma duração de estimulação de 0,2s.
Eléctrodos corneais ou auriculares ?

Quando o teste do electrochoque máximo começou a ser largamente implantado em todos os laboratórios com estudos no âmbito da epilepsia e de novos antiepilépticos, eram utilizados preferencialmente os eléctrodos corneais. Depois, pouco a pouco (década de 70 e 80), foram sendo introduzidos também os eléctrodos transauriculares, havendo, na década de 80 (Browning e Nelson, 1985) e princípios da década de 90 (Löscher, Fassbender e Nolting, 1991), estudos que afirmaram que, embora os eléctrodos corneais continuassem ainda a ser os mais utilizados, os eléctrodos transauriculares revelavam-se mais efectivos em suscitar crises tónicas. As crises tónicas para além de serem mais facilmente induzidas, manifestavam-se mais severas. Segundo os autores referidos, a maior severidade das crises parece dever-se ao facto dos eléctrodos transauriculares activarem preferencialmente a região do tronco cerebral, onde se supõe que as crises tónicas têm o seu substracto anatómico. A estimulação através da córnea parece activar preferencialmente regiões frontais do cérebro, só activando mais tarde o tronco cerebral, se a intensidade do estímulo assim o permitir, daí resultando crises tónicas de menor severidade. Um trabalho realizado por André, Didier e Nehling (2002), no qual foi estudada a variação do fluxo sanguíneo cerebral, nas diversas fases que compõem o teste MES, viria a confirmar o envolvimento de tais estruturas.

A estimulação transcorneal parece induzir crises menos severas, o que se traduz por aumento da latência para a extensão e diminuição da duração da extensão, ou seja, regista-se aumento da componente flexora e diminuição da componente extensora da fase tónica. A estimulação corneal pode produzir clónus facial e dos membros anteriores a níveis baixos de estimulação, clónus (Running & Bouncing clonus) a maiores valores de intensidade e tónus a níveis ainda mais superiores de estimulação eléctrica. A estimulação transauricular activa primeiro o córtex cerebral e só depois as regiões frontais do cérebro. Deste modo, o clónus facial e dos membros anteriores produzido por estimulação transcorneal, nunca é induzido por estimulação transauricular, independentemente da intensidade da corrente (Browning e Nelson, 1985). A estimulação transauricular permite obter menor percentagem de ratos não extensores. Face ao exposto, começámos por tentar utilizar eléctrodos transauriculares. Todavia, a implementação da técnica mostrou-se completamente impossível com as condições laboratoriais disponíveis. Recorremos, pois, aos eléctrodos corneais, mostrando-se a técnica experimental após a sua optimização, fácil de executar e relativamente rápida.
Selecção da via de administração

Independentemente do antiepiléptico com que se esteja a trabalhar, a via parenteral deverá ser a primeira via de administração a ser seleccionada nos estudos pré-clínicos, passando-se só posteriormente, para estudos per os (Löscher e Schmidt, 1988).

Assim, Castel-Branco (2002) nos estudos farmacocinéticos preliminares, optou pela via intraperitoneal, já que a elevada vascularização do peritoneu assegurava a incorporação do fármaco na circulação sistémica num curto espaço de tempo. Efectivamente este facto viria a confirmar-se, registando-se picos plasmáticos logo ao fim de 15 minutos, o que é sugestivo de uma “entrada quase imediata” do fármaco para o plasma após a sua a sua administração. Não era viável utilizar, a via endovenosa atendendo a que o peso dos animais utilizados (250-320g) exigiram que elevados volumes de solução aquosa fossem injectados (500-640μL). Estes volumes não eram susceptíveis de ser administrados na veia, da cauda do animal.

Selecção da formulação e do veículo

A lamotrigina apresenta características de elevada lipossolubilidade, características estas que favorecem a sua fácil penetração através da barreira hematoencefálica. Todavia, estas características de lipofilia podem tornar-se um “entrave”, quando se pretende fazer a sua administração por via intraperitoneal. Perante estes factos, e partindo do conhecimento de que: 1) às suspensões está associada uma absorção mais lenta como consequência da maior dificuldade apresentada pelas partículas para atravessarem o peritoneu; 2) que quando se comparam soluções aquosas e lipofílicas é dada primazia às primeiras, já que nas segundas os fármacos apresentam maior dificuldade para se libertarem do veículo onde se encontram dissolvidos; 3) que, no que se refere à natureza do veículo envolvido, Löscher, Nolting e Fassbender (1990), referiram a existência de alguns veículos de natureza lipofílica capazes de potenciar a acção anticonvulsivante de certos fármacos e, que por outro lado, 4) veículos como o polietilenoglicol 400 até 30% ou o glicofurol até 10%, podem ser utilizados para preparação de soluções de fármacos no caso de estes terem baixa solubilidade aquosa, uma vez que não aumentam o limiar de excitabilidade nem potenciam a acção dos fármacos em estudo, Castel-Branco et al. (2002a) procederam ao estudo de 3 formulações distintas. Assim, foram avaliadas: solução lipofílica de lamotrigina em propilenoglicol a 50%; solução aquosa de lamotrigina sob a forma de isotionato de lamotrigina e suspensão de lamotrigina em metilcelulose a 0,25%. Concluíram estes autores que a solução aquosa de lamotrigina dissolvida em água destilada constituía a formulação mais adequada para a realização dos estudos cinéticos. Atendendo a estes resultados utilizámos a solução aquosa de lamotrigina sob a forma de isotionato de lamotrigina. Após a dissolução, a solução aquosa deverá ser devidamente protegida da acção da luz, devendo-se este cuidado à fotossensibilidade manifestada pela lamotrigina.
Selecção da dose

Os estudos farmacocinéticos preliminares foram realizados com a administração de lamotrigina em 3 doses: 5, 10 e 20 mg/kg. Todavia, a dose de 10 mg/kg já tinha sido referida por Wheatley e Miller (1989) como a dose que desencadeia uma resposta anticonvulsivante no rato, para além do facto desta dose parecer proporcionar a obtenção de níveis plasmáticos nos ratos semelhantes à margem terapêutica proposta para os doentes epilépticos.


Determinação do “Time of peak drug effect”

Deve ser determinado o mais cedo possível, nos estudos pré-clínicos, a fim de evitar falsas conclusões em diferentes modelos animais. Uma vez determinado pelo teste do electrochoque máximo, o fármaco em estudo deverá ser sempre testado nesse ponto, qualquer que seja o modelo experimental seleccionado (Swinyard, Brown e Goodman, 1952; Löscher e Schmidt, 1988). O pico de actividade anticonvulsivante da lamotrigina constitui um ponto chave na caracterização do seu perfil anticonvulsivante, tendo sido determinado nesta etapa.

O protocolo experimental foi dividido em quatro etapas:

1) Teste em Branco;

2) Caracterização do perfil anticonvulsivante da lamotrigina;

3) Modelização farmacodinâmica, através da utilização conjunta dos valores das concentrações plasmáticas e cerebrais, e o efeito anticonvulsivante, traduzido pela percentagem de ratos protegidos no teste MES;

4) Avaliação e quantificação da actividade anticonvulsivante da lamotrigina.
1. Teste em branco
Algumas estirpes animais podem manifestar-se refractárias ao electrochoque e não apresentar a extensão tónica dos membros posteriores (Zablock e Esplin, 1964). Atendendo a que todos os animais a utilizar no protocolo experimental terão que apresentar essa componente da fase tónica de uma forma expressiva (trata-se de um fenómeno de “tudo ou nada”), tivemos que realizar o teste em branco antes da administração do fármaco em estudo. Zablocka e Esplin (1964), após diversos testes eléctricos e químicos, admitiram que a incapacidade de alguns ratos não apresentarem a extensão tónica dos membros posteriores poderá ser justificada pelo facto da descarga eléctrica anormal não ter capacidade de se propagar. Esta incapacidade, segundo os mesmos autores, não poderá ser encarada como um simples “defeito genético”. A propagação da descarga ao longo do cérebro constitui apenas uma das etapas das crises geradas no teste do electrochoque máximo. Efectivamente, esta etapa segue-se às descargas consecutivas numa determinada porção do cérebro. A última etapa diz respeito à integração da descarga supra espinal a nível da espinal medula (Zablocka e Esplin, 1964).

O teste em branco consistiu, então, em três ensaios realizados com 48 horas de intervalo (Swinyard, Brown e Goodman, 1952; Browning e Nelson, 1985; Ramzam e Levy, 1989) e nos quais os animais receberam, de uma só vez, choques eléctricos (150 mA de intensidade, 60 Hz de frequência, 0,6ms de amplitude durante 0,2s), através de eléctrodos corneais. Segundo Woodbury e Davenport (1952), é extremamente importante que seja respeitado este intervalo entre os choques, a fim de evitar a alteração do limiar de excitabilidade.

Como a intensidade da corrente aplicada é muito superior ao limiar de excitabilidade dos animais, não tivemos que nos preocupar com as flutuações diárias daquele parâmetro, servindo então, cada animal, como o seu próprio controlo. Por outras palavras, este nível de estimulação não enviesa a indução de crises tónicas. Há ainda a referir que caso os animais sejam manipulados de acordo com as directivas europeias, o limiar de excitabilidade pode considerar-se praticamente constante (Woodbury e Davenport, 1952; Löscher, Fassbender e Nolting, 1991). Segundo os estudos levados a cabo por Woodbury e Davenport (1952), as variações de limiar de dia para dia são insignificantes (p>0,2), enquanto a variação de animal para animal já é significativa (p<0,001).

Após a aplicação dos choques eléctricos os animais apresentaram convulsões tónico-clónicas típicas. Para além da ocorrência ou não de extensão tónica (fenómeno de “tudo ou nada”), registou-se a duração das fases tónica e clónicas, sendo intenção deste procedimento a eventual comparação em etapas posteriores do projecto de investigação em curso. Efectivamente, estas avaliações adicionais servem para elucidar qual o efeito do fármaco em estudo em cada uma das fases, já que estas informações podem eventualmente ser úteis na elucidação do seu mecanismo de acção (Novack, Stark e Peterson, 1978).

Os ratos começaram por apresentar uma fase tónica composta por uma componente de flexão e posteriormente por extensão. Os animais apresentaram flexão dos membros com ligeiro tremor a que se seguiu a extensão dos membros posteriores. A fase tónica considerou-se concluída, quando ocorreu um relaxamento abrupto da musculatura e os animais começaram a respirar. O clónus iniciava-se então e rapidamente se propagava por todo o corpo do animal. Terminada esta fase clónica, sucedia-se um período de depressão que antecedia a recuperação completa do animal. É de referir a ausência de crises recorrentes, mesmo após a ocorrência de severas crises tónico-clónicas. Os animais que não apresentaram estas duas fases perfeitamente definidas foram excluídos.

Com a estimulação “supra-máxima” é induzida a extensão tónica; todos os circuitos neuronais capazes de contribuir para a descarga eléctrica são activados ao máximo e a convulsão, uma vez iniciada, não pode ser modificada (Toman, Swinyard e Goodman, 1946). Admite-se que, ao ocorrer a extensão tónica, ocorre a máxima dissipação de energia de que o cérebro é capaz. Os animais que apresentaram somente crises clónicas e que, por isso, foram excluídos, recuperaram muito mais rapidamente do que os animais que apresentaram as duas fases perfeitamente definidas.



2. Caracterização do perfil anticonvulsivante da lamotrigina
Depois de se terem seleccionado os animais, procedeu-se à caracterização do perfil anticonvulsivante, no teste do electrochoque máximo que, como já referimos, é um modelo padronizado de crises generalizadas tónico-clónicas, durante um período de 48 horas. Os estudos farmacocinéticos preliminares decorreram num período de 120 horas. Todavia, ao fim de 48 horas, a lamotrigina não conferiu nenhuma protecção, pelo que se restringiu o estudo àquele intervalo de tempo. Foram criados grupos de 8 animais (Löscher, Fassbender e Nolting, 1991) e, após a administração intraperitoneal de lamotrigina em dose única de 10 mg/kg sob a forma de solução aquosa, cada grupo foi testado uma única vez a um tempo pré-determinado: 15 e 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 48 horas (Castel-Branco et al., 2003b,c). A selecção destes tempos teve em consideração trabalhos existentes, nos quais foi avaliado o efeito anticonvulsivante da lamotrigina de uma “forma isolada” (Leach, Lamb e Miller, 1986; Miller et al.,1986b; Dalby e Nielsen, 1997) ou em estudos comparativos com outros fármacos também bloqueadores dos canais de sódio (Rataud et al., 1994), bem como em estudos cinéticos realizados no próprio laboratório da FFUC (Castel-Branco, 2002). Durante a estimulação com os eléctrodos corneais os animais viram os seus movimentos restringidos apenas com a mão e, após aplicação do estímulo, estes ficaram apenas presos pela cauda, a fim de se poder observar todo o curso da crise convulsiva induzida (Löscher e Lehmann, 1996). Tal como no teste em branco, foi monitorizada a duração das fases tónicas e clónicas, embora seja de referir que a extensão tónica dos membros posteriores seja, só por si, um bom indicador do efeito do fármaco nas convulsões (Novack, Stark e Peterson, 1978). Foi registado o número de animais que se encontravam protegidos ao fim de cada intervalo do tempo referido. Fazendo-se este estudo ao longo de 48 horas, tornou-se possível determinar o ponto em que a actividade da lamotrigina foi máxima: “Peak drug effect” e o intervalo de tempo em que se faz sentir a sua protecção. A actividade foi considerada máxima quando todos os animais do mesmo grupo manifestaram ausência de extensão tónica dos membros posteriores (8 ratos protegidos).

Analisando os resultados constantes da Tabela R.1. à Tabela R.3., verifica-se que a lamotrigina se mostrou efectiva ao fim de 15 minutos, que constituiu o intervalo de tempo mais curto testado; a actividade foi máxima no intervalo compreendido entre as 2 e as 4 horas pós-dose. Após este pico de actividade, verifica-se um decréscimo do efeito anticonvulsivante (traduzido pelo número de animais protegidos contra o teste do electrochoque máximo), embora até às 12 horas seja registado um elevado nível de protecção (>50%). Ao fim de 48 horas nenhum animal se revelou protegido. Face a este último facto e tal como já foi referido, o estudo do efeito anticonvulsivante deu-se por terminado, apesar dos estudos farmacocinéticos terem sido conduzidos até às 120 horas, altura em que também foram finalizados, atendendo a que os níveis atingidos já não eram susceptíveis de serem detectados pela técnica analítica (Castel–branco, 2002).

Os animais protegidos não manifestaram a fase tónica, iniciando-se um clónus generalizado praticamente após a aplicação do estímulo eléctrico. Esta fase clónica, para além de ser mais longa mostrou-se igualmente mais severa do que no teste em branco. Após a fase clónica apresentaram um pequeno período de depressão, findo o qual rapidamente recuperaram.

Os animais não protegidos apresentaram uma fase tónica ligeiramente mais curta e uma fase clónica ligeiramente mais longa do que os controlos, mas não mais severa. Estes animais demoraram mais tempo a recuperar, pois ficaram visivelmente mais cansados e apáticos.

Os resultados obtidos nesta etapa do protocolo experimental revelaram-se semelhantes aos obtidos por Miller et al. (1986b). Efectivamente, estudos realizados por estes investigadores revelaram que a lamotrigina, após administração oral, é eficaz ao fim de 15 minutos, atingindo o pico da potência anticonvulsivante 1 hora após a sua administração. O estudo realizado ao longo do tempo revela também que esse nível de potência se mantém durante pelo menos 8 horas após a toma e que a acção anticonvulsivante da lamotrigina ainda se faz sentir de um modo significativo 24 horas após a sua administração, sugerindo uma acção de longa duração.

Quando o efeito anticonvulsivante (traduzido pela percentagem de ratos protegidos no teste do electrochoque máximo) foi correlacionado com os níveis plasmáticos e cerebrais previamente determinados e registados em função do tempo (0,25-48 horas) (Castel-branco, 2002) (Tabela R.5), facilmente nos apercebemos de que o efeito anticonvulsivante se correlaciona fortemente com os níveis cerebrais. Assim, ao máximo de protecção anticonvulsivante corresponde máxima concentração cerebral (Ccerebral=1,63 mg/L). Ao representarmos este conjunto de três resultados, obtivemos a Figura R.1.

A relação entre as curvas plasmáticas e cerebrais representadas graficamente já foi objecto de análise por parte de Castel-Branco (2002) e também por Castel Branco et al. (2002b e 2003c). Muito sucintamente, podemos realçar os aspectos mais importantes: a lamotrigina, após ser administrada por via intraperitoneal e sob a forma de solução aquosa, atinge rapidamente o plasma com um pico às 0,25horas, o que é indicativo de uma rápida absorção a partir da cavidade peritoneal; entre as 0,25, 0,5 e 2 horas não se registam variações plasmáticas quantitativas muito significativas; no cérebro o primeiro pico é registado um pouco mais tarde, atendendo a que a lamotrigina necessita de atravessar a barreira sangue/cérebro para atingir a biofase e que, após os níveis máximos, os dois perfis apresentam um decréscimo monoexponencial. Este declínio das concentrações cerebrais, à semelhança do que acontece a nível do plasma, sugere que a lamotrigina não apresenta uma excessiva retenção no cérebro. Este último facto veio corroborar as conclusões de Walker et al. (2000) e estudos prévios (Parsons, Dickins e Morley, 1995) nos quais era postulado que a lamotrigina apresenta uma velocidade de eliminação dos tecidos, comparável à do plasma. Constituem excepção a esta “regra” os tecidos ricos em melanina e os rins (Parsons, Dickins e Morley, 1995; Castel-branco et al., 2003a).

Castel-Branco (2002) ao fazer um estudo comparativo das curvas- -concentrações cerebrais versus concentrações plasmáticas, por análise de regressão linear, constatou a existência de uma relação de linearidade entre as duas variáveis a partir do momento em que o sistema atinge o equilíbrio (1 hora após a administração).

Na curva representativa do efeito anticonvulsivante, após o intervalo das 2-4 horas também se verifica um decréscimo.

Após a análise gráfica dos resultados obtidos, procurámos estudar a relação concentração-efeito (concentração plasmática/efeito e concentração cerebral/efeito) recorrendo a modelos matemáticos adequados (modelização farmacodinâmica). A modelização farmacodinâmica é considerada uma etapa chave em quaisquer estudos pré-clínicos. De facto, com esta análise é possível estabelecer uma adequada relação concentração-efeito, a partir da qual qualquer que seja a dose de fármaco administrada é possível prever a magnitude da resposta fisiológica suscitada (Schwinghammer e Kroboth, 1988; Derendorf e Meibohm, 1998).
3. Modelização farmacodinâmica
Foram seleccionados os quatros modelos matemáticos mais largamente usados em estudos farmacodinâmicos: Modelo linear, Modelo log-linear, Modelo Emax e Modelo sigmoidal Emax). Os valores experimentais foram ajustados a cada uma das equações, descritivas destes modelos, por regressão não linear, utilizando para o efeito o WinNonlin®.

A selecção do melhor modelo foi feita com base no critério de Akaike (AIC-Akaike’s information criterion), segundo o qual a equação com menor valor de AIC é considerada como a melhor representação dos gráficos de concentração em função do tempo. Para a análise da qualidade do ajuste recorreu-se à análise gráfica dos resultados obtidos e à utilização de critérios estatísticos, como sejam a soma dos quadrados residuais e a diferença entre os valores previstos e os realmente observados.

Tanto no plasma como no cérebro, o modelo farmacodinâmico que melhor pareceu descrever a relação concentração/efeito foi o modelo sigmoidal Emax.

As relações concentrações/efeito revelaram também ser adequadamente descritas pelo modelo linear (modelo da regressão linear simples), que pode ser considerado um caso específico do modelo sigmoidal Emax. Atendendo ao facto de ser um modelo mais simples que o sigmoidal Emax decidimos proceder a um estudo mais aprofundado por análise de regressão linear. Os resultados obtidos são os constantes da Tabela R.8 e das Figuras R.2 e R.3.

A análise de regressão efectuada entre o perfil cerebral da lamotrigina versus perfil anticonvulsivante, no intervalo das 0,25-48 horas, apresentou um coeficiente de determinação muito próximo da unidade (r2 = 0,937), o que é indicador da existência de uma relação linear entre aquelas duas variáveis.

Quando se efectuou a mesma análise (perfil plasmático versus perfil anticonvulsivante) obtivemos um coeficiente de determinação já um pouco afastado da unidade (r2 = 0,684). Todavia, quando nova análise foi efectuada, rejeitando os primeiros valores experimentais (0,25 e 0,5 horas), já se obteve um coeficiente de determinação, bastante próximo da unidade (r2 = 0,930). Este resultado sugere a existência de uma forte relação entre os níveis plasmáticos e a resposta farmacológica desencadeada, no intervalo das 1-48 horas pós-dose.

Se analisarmos mais detalhadamente a Tabela R.6 até à 1 hora, constata- -se que os níveis plasmáticos de lamotrigina são elevados, não sendo, no entanto, acompanhado por um aumento proporcional dos níveis cerebrais. Esta elevação rápida dos níveis plasmáticos já foi devidamente justificada e também se compreende que neste intervalo a lamotrigina ainda “não teve tempo suficiente” para atravessar completamente a barreira sangue/cérebro e chegar aos locais neuronais de acção. Ao não atingir em pleno o sistema nervoso central não exerce o efeito anticonvulsivante desejado, logo, neste intervalo, atingem-se valores de protecção que ainda estão um pouco aquém da protecção máxima, que viria a registar-se só entre as 2 e 4 horas pós-dose.

Perante estes factos podemos, então, concluir que se verifica uma forte relação entre os níveis cerebrais e o efeito anticonvulsivante. Do mesmo modo, a relação entre os níveis plasmáticos e o efeito anticonvulsivante é linear a partir do momento em que o sistema plasma-cérebro atinge o equilíbrio.

Ao fim de 12 horas obteve-se um percentagem de protecção de cerca de 62,5% e ao fim de 24 horas verifica-se uma descida brusca para 12,5%. Embora estes factos se registem a nível do efeito anticonvulsivante, é curioso notar que os níveis cerebrais não desceram tão bruscamente. Para explicar devidamente este facto teríamos de recorrer a técnicas mais especializadas, como a microdiálise, a fim de estudar se a discrepância observada se poderia justificar pela existência de modificações no ratio fármaco não ligado/fármaco ligado naquele intervalo de tempo ou eventualmente, pelo aparecimento de alguma espécie de tolerância (Potschka, Fedrowitz e Löscher, 2002). Todavia, pensamos que este facto, não impede que aquelas duas variáveis (concentrações cerebrais versus efeito anticonvulsivante) se representem graficamente por uma linha recta.

A ausência de protecção contra a extensão tónica dos membros posteriores induzida pelo teste MES ao fim de 48 horas pós-dose está em conformidade com os baixos níveis determinados no plasma (1,52 μg/mL) e no cérebro (0,65 μg/mL).



Tendo em consideração a existência de linearidade entre a dose de lamotrigina administrada e os níveis plasmáticos e cerebrais atingidos, entre os níveis cerebrais e a resposta farmacológica, assim como entre os níveis plasmáticos e o efeito anticonvulsivante, a partir do momento em que o sistema atinge o equilíbrio, estamos em condições de afirmar que os níveis plasmáticos são bons indicadores da concentração de lamotrigina nos seus locais neuronais de acção (a partir do momento que o sistema atinge o equilíbrio) e que, como tal, se correlacionam fortemente com o efeito anticonvulsivante da lamotrigina.
4. Avaliação e quantificação da actividade anticonvulsivante

da lamotrigina
A potência anticonvulsiva da lamotrigina foi avaliada através da determinação da dose capaz de suprimir as crises tónicas em 50% dos animais (ED50) (dalby e Nielson, 1997). Para o efeito os animais foram também submetidos a um teste em branco e só aqueles que exibiram consistentemente a extensão tónica dos membros posteriores em três ensaios preliminares, realizados em dias separados, foram seleccionados (Swinyard, Brown e Goodman, 1952; Browning e Nelson, 1985; Ramzam e Levy, 1989). Os animais foram seguidamente divididos em grupos de 8. A cada grupo foi administrado uma dose diferente (1, 3, 4,5, 6 ou 10 mg/kg) e testado no pico de actividade anticonvulsivante, que tinha sido determinado na etapa anterior. Assim, ao fim de 2 horas, foi aplicado o electrochoque e a resposta de cada animal foi observada e registada. Analisando os resultados da Tabela R.10 constatou-se que a dose de 1 mg/kg não induziu nenhum nível de protecção. À medida que a dose foi aumentando o nível de protecção aumentou até se atingir 100% de animais protegidos com a dose de 10 mg/kg. Representando graficamente estes resultados e colocando em abcissas as doses e em ordenadas a percentagem de animais protegidos, obtivemos uma curva dose-efeito sigmóide (Figura R.4). Em abcissas registaram-se as doses administradas e em ordenadas a percentagem (%) de animais protegidos, que traduz o efeito anticonvulsivante. O estudo de regressão não linear (WinNonlin®) proporcionou um coeficiente de determinação de (r2 = 0.999); intervalo de confiança de 95% (IC95% = 3,172) e um parâmetro farmacodinâmico ED50 de 4,1mg/kg. O valor de ED50 obtido está dentro do intervalo de valores registados por outros autores, usando outras doses, outras vias de administração, outras espécies animais e/ou outro equipamento. Assim, os valores médios mais baixos de ED50 encontrados por Miller et al. (1986b) foram determinados 1 hora após a administração oral da lamotrigina e são de 2,6 mg/kg e 1,9 mg/kg para murganhos e ratos, respectivamente. A potência anticonvulsivante da lamotrigina após a sua administração por diferentes vias revelou-se semelhante: em ratos, os valores de ED50 são de 2,0; 2,4; 3,6 e 3,0 mg/kg 2 horas após administração oral, subcutânea e intraperitoneal e 1 hora após administração endovenosa, respectivamente (Miller et al., 1986a,b). Rataud et al. (1994) referem valores de ED50 de 4,4 mg/kg (murganhos) e 3,1 mg/kg (ratos) 30 minutos após a administração intraperitoneal de lamotrigina. Dalby e Nielsen (1997), referem o valor de 36 mol/kg (9,2 mg/kg) para o ED50 em murganhos 2 horas após a administração intraperitoneal de lamotrigina.






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