EstimaçÃo da fraçÃo de não-disjunçÃo meiótica em pacientes com síndrome de down glaura da Conceição Franco* Paula Arantes Barros Departamento de Estatística ufmg



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ESTIMAÇÃO DA FRAÇÃO DE NÃO-DISJUNÇÃO MEIÓTICA EM PACIENTES COM SÍNDROME DE DOWN


Glaura da Conceição Franco*

Paula Arantes Barros
Departamento de Estatística - UFMG


* Departamento de Estatística – ICEx – UFMG – Caixa Postal 702

Belo Horizonte – MG - Brazil – 31.270-901



glaura@est.ufmg.br - Tel: 55(31)3499-5949 – Fax: 55(31)3499-5924

Agradecimentos
Este trabalho contou com o apoio do CNPq através da bolsa PIBIC para a aluna Paula Arantes Barros. Gostaríamos também de agradecer ao Prof. Dr. Sérgio Danilo Pena e Flávia C. Parra, do Departamento de Bioquímica e Imunologia da UFMG, pelo material da pesquisa.

RESUMO


As trissomias cromossômicas ocorrem principalmente devido ao processo de não-disjunção na meiose. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo subjacente da não-disjunção, é necessário estabelecer a proporção de casos que ocorrem na primeira ou segunda divisão meiótica. Pacientes trissômicos apresentam, em estudos de microssatélites empregando a Reação em Cadeia da Polimerase (RCP), três fragmentos de igual intensidade, dois fragmentos a uma taxa de 2:1 ou um único fragmento. Neste trabalho é apresentado um modelo de probabilidade para o número de picos em um locus de microssatélite polimórfico, que é uma função da fração de não-disjunção na meiose I, F. Baseado neste modelo, o estimador de máxima verossimilhança para F é obtido, usando a proporção observada de um, dois e três alelos em indivíduos com trissomia do cromossomo 21. A partir das propriedades da teoria de máxima verossimilhança, são calculados a variância assintótica e intervalos de confiança para F. Devido ao fato de que as trissomias cromossômicas são eventos raros, o uso da teoria assintótica por ficar comprometida. Assim, a técnica bootstrap é empregada para construir intervalos de confiança para F e comparar os resultados com aqueles obtidos da teoria normal.

Palavras-Chaves: Trissomia, não-disjunção, Máxima Verossimilhança, Bootstrap, Intervalos de Confiança.


ABSTRACT


Chromosome trisomy primarily arises by the process of nondisjunction in meiosis. In order to increase our understanding of the mechanisms underlying nondisjunction, it is necessary to establish the proportion of cases occurring in first or second division of meiosis. Trisomic patients will display, in study of microsatellite by employing Polymerase Chain Reaction (PCR) based approach, three fragment peak of equal intensity, two fragments at an average 2:1 dosage or one individual fragment. In this work we present a probability model for the number of peaks in a polymorphic microsatellite locus, which is a function of the fraction of meiosis I nondisjunction, F. Based on this model, we obtain a maximum likelihood estimator for F, using the observed proportion of one, two and three allele patterns in individuals with chromosome trisomy. Relying on the properties of maximum likelihood theory, we also calculate the asymptotic variance and confidence intervals for F. Due to the fact that chromosome trisomies are rare events, the use of asymptotic theory may be compromised. Thus, we employ the bootstrap technique to build confidence intervals for F and compare the results with those obtained from the normal theory.

Keywords: Trisomy, Nondisjunction, Maximum Likelihood, Bootstrap, Confidence Intervals.

1. INTRODUÇÃO


As anomalias cromossômicas numéricas, chamadas aneuploidias, são causas comuns de morte fetal e de malformações congênitas. Estas ocorrem geralmente como eventos esporádicos de não-disjunção meiótica. Dentre as aneuploidias, a mais estudada é a trissomia do cromossomo 21, vista em aproximadamente um em 750 nativivos. Ela produz um fenótipo conhecido como síndrome de Down e é a causa mais comum de retardo mental de origem genética em humanos. A síndrome de Down é causada pela presença de três cromossomos 21, sendo um cromossomo extra.

Para melhor entendimento da epidemiologia desta trissomia é necessário estabelecer a função de probabilidade de que ela ocorra na primeira ou segunda divisão meiótica. Até agora a estimativa de F (a probabilidade condicional de que não-disjunções ocorram na meiose I) tem feito uso do estudo comparativo de marcadores genéticos centroméricos na criança afetada e em seus pais. A necessidade do estudo dos pais complica estes estudos e impossibilita o uso de material de arquivo. Uma outra alternativa utilizada pelos pesquisadores é fazer a análise do fracionamento por densitometria a laser utilizando a amplificação através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (Parra, 1999).

No estudo de locus de microssatélites polimórficos, pela reação em cadeia da polimerase (PCR), pacientes trissômicos apresentam: a presença de três picos de mesma intensidade, dois picos com uma dosagem relativa 2:1 ou apenas um pico (casos não-informativos). Para a ocorrência do padrão de 3 picos em um feto trissômico, é necessário que a não-disjunção ocorra na meiose I e que sejam transmitidos 3 alelos diferentes dos pais.

Se conhecermos a proporção F de casos de não-disjunção na primeira divisão meiótica e as freqüências relativas (p1, p2, ... , pm) dos m alelos de um loco multialélico de microssatélites, podemos aplicar o equilíbrio de Hardy-Weinberg para calcular a freqüência relativa esperada dos padrões de 1, 2 e 3 picos já que as freqüências genotípicas têm distribuição multinomial.

O estimador de máxima verossimilhança (EMV) para F, baseado no modelo de probabilidade para a fração F de não-disjunção na meiose I apresentado em Franco et al. (2003), utiliza a proporção observada de padrões de um, dois ou três picos em uma amostra de indivíduos trissômicos. Através das propriedades assintóticas do EMV é possível calcular a variância assintótica destes estimadores usando a matriz de informação observada (Welsh, 1996).

O objetivo principal deste trabalho é comparar os Intervalos de Confiança para a fração de não-disjunção F, utilizando a teoria normal e intervalos bootstrap percentílicos, através de uma aplicação a dados reais.

2. GENÉTICA



2.1 MEIOSE

A meiose é um processo de reprodução sexual através do qual o número cromossômico das células germinativas diplóides (2n) é reduzido à metade (n) na formação das células reprodutivas maduras ou gametas.



Em um indivíduo normal, essa redução é obtida através de duas divisões celulares sucessivas, durante as quais os cromossomos são duplicados apenas uma vez. Procedendo a primeira das duas divisões, os cromossomos homólogos são pareados e duplicados. Esses cromossomos pareados são separados na primeira divisão meiótica da célula. Na segunda divisão meiótica, as duas cromátides de cada cromossomo separam-se, produzindo um total de quatro células sexuais maduras, cada uma capaz de fertilização. Uma explicação mais detalhada do processo de meiose pode ser vista em Gardener e Swstad (1986).

2.2 TRISSOMIA DO CROMOSSOMO 21
A trissomia do 21 é o resultado da não-disjunção primária, que pode ocorrer em ambas as divisões meióticas e em ambos os pais. Os cromossomos pareados não se separam de forma apropriada para os pólos na anáfase; um dos gametas receberá dois cromossomos 21 e o outro nenhum. As figuras 1a e 1b apresentam processos de meiose com a não-disjunção ocorrendo na 1a e 2a fases, respectivamente. Sem perda de generalidade, ilustraremos o processo com a não-disjunção ocorrendo na mãe de um indivíduo trissômico.

Figura 1a: Não-disjunção na 1a fase da meiose em indivíduos trissômicos



A A


C

A A C

OU


Figura 1b: Não-disjunção na 2a fase da meiose em indivíduos trissômicos




2.3 Análise da origem das trissomias através da PCR
A análise da origem das trissomias é feita através da utilização de marcadores moleculares dos cromossomos, explorando regiões polimórficas do DNA. Por serem altamente informativos, os polimorfismos de DNA permitem a determinação da origem das trissomias na maioria dos casos, além de propiciarem uma análise mais objetiva.

A introdução da técnica de amplificação do DNA através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) permitiu a identificação de um grande número de marcadores denominados microssatélites, mapeados ao longo dos diversos cromossomos (Pena, 1998). Os microssatélites são unidades curtas de DNA de 1 a 5 pares de base que se repetem seguidamente. Estes marcadores puderam ser estudados em conjunto através da PCR, possibilitando um resultado mais rápido e ainda mais informativo.





    1. Padrões de picos em indivíduos trissômicos

Em estudos com microssatétites polimórficos, indivíduos portadores de trissomias apresentam padrões de um, dois ou três picos (ver figura 3). O padrão de um pico indica a igualdade entre os três alelos herdados pelo indivíduo. Padrões de dois picos, normalmente, estão em uma dosagem relativa de 2:1, indicando a presença de dois alelos iguais e um de tamanho diferente e o padrão de três picos de mesma intensidade equivale à presença de três alelos com tamanhos diferentes.

A proporção relativa de cada um dos padrões de um, dois e três picos vai depender, principalmente, do momento do acidente meiótico, além do índice de heterozigosidade do loco na população. Ignorando recombinações, para que ocorra um padrão de três picos, é necessário que o erro na segregação dos cromossomos tenha ocorrido na primeira divisão meiótica e que sejam transmitidos 3 alelos diferentes dos pais, provenientes de dois cromossomos homólogos de um dos genitores, e um cromossomo diferente, herdado pelo outro genitor. A não ser quando o genitor que transmitiu os dois cromossomos homólogos seja homozigoto, o padrão de dois picos retrata uma situação em que a não-disjunção acontece na segunda divisão, quando as cromátides irmãs permanecem unidas.

A detecção molecular de trissomias humanas usando PCR e densitometria a laser (Pena, 1998) surgiu, portanto, como uma poderosa ferramenta alternativa para o diagnóstico aplicado em tecidos humanos que não estão em divisão, o que não é permitido na citogenética convencional.



I) 1 PICO (três alelos iguais ):


II) 2 PICOS ( dois alelos iguais ):


III) 3 PICOS (três alelos diferentes ):

Figura 2: Desenho esquemático no número de picos


3. Estimação de F




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