Efeito da ozonioterapia no modelo experimental murino de vulvovaginite com Candida albicans



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Efeito da ozonioterapia no modelo experimental murino de vulvovaginite com Candida albicans
Dayane Batista Franzes(PIBIC/Fundação Araucária/Unioeste); Larissa Carolina Dierings, José Henrique Fermino Ferreira dos Santos, Eduardo Alexandre Loth(Orientador), e-mail: dayane.franzes@hotmail.com
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Ciências Biológicas e da Saúde/Cascavel, PR.
Ciências da Saúde - Microbiologia
Palavras-chave: Candida albicans, Ozonioterapia, Vulvovaginite.
Resumo

analisar os efeitos da ozonioterapia de baixo custo em Candida albicans, in vitro e in vivo. Fase in vitro: 3 cepas micotecadas de C. albicans foram cultivadas por 24 horas, diluídas em água destilada e semeadas. As placas foram submetidas à liberação de ozônio por 30 segundos, 1 minuto, 2,5 minutos e 10 minutos. As cepas também foram testadas na água. Após a diluição em água destilada, procedeu-se a ozonização das suspensões por 30 segundos, um minuto e 2,5 minutos. Após ambos os procedimentos, houve plaqueamento das suspensões e a contagem de Unidades Formadoras de Colônia ocorreu após 24-48h. Fase in vivo: 24 camundongos fêmeas foram divididas em 4 grupos: Grupo controle absoluto (GCA), grupo controle (GC), grupo ozonioterapia (GO), grupo lavagem (GL). Foi desenvolvido o modelo de vulvovaginite em todos os grupos, exceto no GCA. A infecção foi monitorada semanalmente por coleta e análise do lavado vaginal. O GO foi tratado com lavagem vulvovaginal com água ozonizada e o GL, lavagem com água destilada. Após o terceiro dia de tratamento, os animais foram eutanasiados. in vitro, tanto os ensaios com ozônio na água quanto no ar se mostraram eficazes, sendo que a placa que recebeu 2,5 minutos de aplicação de ozônio em meio aquático não obteve crescimento de unidades formadoras de colônia (CFU). In vivo os grupos tratados com ozônio apresentaram redução no número de CFU e os exames anatomopatológicos desses grupos apresentaram infiltrados inflamatórios mais discretos que os do grupo não tratado.


Introdução
A Candida albicans está entre os microorganismos que vivem no sistema digestivo, sem apresentar manifestações agressivas à saúde, exceto se houver comprometimento imunológico do hospedeiro. Entre as manifestações prejudiciais deste fungo, destaca-se Candidíase Vulvovaginal (vulvovaginite) (Naglik Jr et. al., 2003).

O tratamento para esta condição é realizado através de medicamentos antifúngicos que apresentam grande eficácia, mas podem ter alto custo e apresentarem muitos efeitos colaterais. Uma proposta simples, de baixo custo, fácil acesso e com poucos efeitos colaterais para o tratamento é o uso da ozonioterapia. O ozônio medicinal estimula a circulação sanguínea, possui propriedades bactericidas, fungicidas e antivirais e ativa o sistema imunológico do organismo, tornando-o mais resistente (Associação Brasileira de Ozonioterapia).


Material e Métodos
Este estudo foi conduzido em duas etapas, a primeira in vitro e a segunda in vivo. Para a etapa in vitro, foram semeados 10 µL de suspensão celular de C. albicans em placas de petri, que foram inseridas no interior de um saco plástico e submetidas à liberação de ozônio por 30 segundos, 1 minuto, 2,5 minutos e 10 minutos. Uma placa não entrou em contato com o ozônio, servindo como controle. Para os testes com água ozonizada, as suspensões foram ozonizadas por 30 segundos, 1 minuto e 2,5 minutos. O número de UFC foi anotado entre 24 e 48 horas após o plaqueamento.

Na segunda etapa, a atividade ovariana de todos os grupos foi suprimida e os procedimentos seguintes foram distintos em cada grupo: GCA: Foi submetido à inoculação de PBS estéril em dose única de 20µL; GC: Foi submetido à inoculação da suspensão de C. albicans na forma de leveduras, em dose única de 20 µL na concentração de 105 células; GO: Foi submetido à inoculação da mesma forma que o grupo controle, também com suspensão de C. albicans na forma de leveduras; GL: Também foi infectado com a suspensão fúngica, porém não foi realizado o tratamento com ozônio. Esse grupo serviu de controle para o grupo ozonioterapia.

O desenvolvimento do modelo de vulvovaginite foi realizado em todos os grupos, exceto o grupo controle absoluto. Após a suspensão da atividade ovariana, foram inoculados 20 µL de suspensão de C. albicans, PBS, na concentração de 105 células leveduriforme, cerca de 5mm dentro do lúmen vaginal (Yano et. al., 2011).

A infecção foi monitorada semanalmente, da primeira a terceira semana após a infecção. Com a ajuda de uma pipeta de plástico, foi introduzida solução salina estéril (20µL) na vagina e, em seguida, removida imediatamente e semeada em placas de Petri contendo ASD-cloranfenicol. A solução foi incubada a 25ºC, durante 48-72 h. A infecção era considerada positiva se pelo menos uma colônia de levedura crescer para contagem individual, e uma contagem média de todas as culturas a partir de cada rato ≥ 10 UFC/mL. O mesmo procedimento foi realizado nos camundongos do grupo controle.

O grupo controle absoluto não recebeu a suspensão fúngica, somente PBS estéril, na mesma quantidade.

No tratamento, o grupo ozonioterapia foi submetido à lavagem vulvovaginal com água ozonizada. Para tanto, utilizou-se 10 mL de água destilada previamente ozonizada, para imediatamente instilação vaginal. O grupo lavagem foi submetido ao mesmo procedimento, porém com água destilada, não ozonizada. O tratamento foi realizado durante 3 dias.

Imediatamente antes da eutanásia dos animais, foi realizado o procedimento de coleta do lavado, instilando 50 µL PBS estéril na vagina de cada animal e aspirando-se imediatamente em seguida. A coleta desse material foi utilizada para contagem de Unidade Formadora de Colônia. Os animais foram eutanasiados para retirada dos tecidos vulvovaginais e análise histológica.
Resultados e Discussão
Resultados in vitro
O número de UFC obtido em cada placa foi comparado ao número de UFC observado na placa controle entre 24 e 48 horas após o plaqueamento (p=0,001).
Tabela 1. Demonstração dos resultados após a contagem do número de unidades formadoras de colônias (Ufc).


INTERVENÇÃO

Nº UFC/ML

Sem intervenção (controle)

720

Ozônio - ar – 30s

810

Ozônio - ar – 1 min

160

Ozônio - ar – 2,5 min

36

Ozônio – ar – 10 min

8

Ozônio – água – 30 s

110

Ozônio – água – 1 min

2

Ozônio – água – 2,5 min

0


Resultados in vivo
O número de UFC encontrado foi menor no grupo tratado com ozônio, quanto comparado com os demais grupos infectados (p=0,001).

Tabela 2. Demonstração dos resultados após a contagem do número de unidades formadoras de colônias do lavado vaginal após o tratamento (Ufc).



INTERVENÇÃO

Nº UFC/ML

CGA

0

GC

356

GO

49

GL

234

O exame anatomopatológico demonstrou áreas com inclusões nucleares no epitélio escamoso estratificado, além de acentuado processo inflamatório com debris celulares, hifas fúngicas e esporos fúngicos, hiperceratose e exsudato leucocitário nos grupos controle e lavagem. O grupo ozonioterapia apresentou formação inflamatória moderada, discreta presença de hipas fungicas, sem debris celulares.

Vale ressaltar que o presente estudo é pioneiro em utilizar ozonioterapia no modelo experimental de vulvovaginite, fato que inviabilizou uma discussão aprofundada sobre o tema.

No entanto, um estudo realizado por Cardoso et. al. (2009), avaliou os efeitos da ozonioterapia no tratamento de feridas em pé diabético. O tratamento consistiu de banhos (hidro-ozonioterapia), seguidos de curativos com óleo ozonizado. Após 14 semanas de tratamento a ferida estava completamente cicatrizada.

Outro estudo feito por Gracer e Bocci (2005) definiu que a aplicação do ozônio no local inflamado favorece a proliferação celular, síntese de matriz extracelular, normaliza o metabolismo, aumenta a quantidade de leucócitos no local e liberam fatores de crescimento, o que facilita a circulação local, estimula o reparo tecidual e a cicatrização.

Traina (2008), também obteve resultados positivos com o ozônio, porém, na reparação de feridas dérmicas em ratos. Os resultados mostraram redução da área da ferida, favorecimento da formação tecidual e ausência de toxicidade.

Um estudo experimental in vitro comparou os efeitos do ar comprimido, dióxido de carbono (CO2), hélio (He) e ozônio (O3) sobre o crescimento bacteriano. Observou-se que não houve crescimento em 100% das cepas expostas ao ozônio, ao contrário dos demais gases, que não influenciaram no crescimento bacteriano (Pereira et. al., 2005).

Resultados semelhantes foram obtidos na presente pesquisa, pois a ozonioterapia se mostrou capaz de reduzir o número de CFU (p=0,001) do microorganismo em questão tanto nos ensaios in vitro, como in vivo. Na etapa in vitro, a eliminação completa do organismo ocorreu com apenas 2,5 minutos de exposição ao ozônio em meio aquático. No modelo experimental de vulvovaginite com C. albicans, se comparada a quantidade de CFU do grupo tratado com ozônio (49 CFU) e do grupo não tratado (356 CFU), a diferença entre as médias é de 726,53%, o que demonstrou a eficácia do ozônio no tratamento contra C. Albicans no modelo utilizado.


Conclusão
Conclui-se com o estudo que a ozonioterapia de baixo custo apresenta-se eficaz para o tratamento contra o microoganismo C. albicans, tanto em sua forma gasosa quanto na ozonização de água destilada.
Agradecimentos
Agradeço a Fundação Araucária, pelo recebimento de bolsa de iniciação científica.
Referências Bibliográficas
Associação Brasileira de Ozonioterapia. Disponível em: <http://www.aboz.org.br/ozonioterapia/>. Acesso em 5 de Abril de 2015.
Cardoso, C. C., Filho, E. D., Pichara, N. L., Campos, E. G. C., Pereira, M. A., & Fiorini, J. E. (2010). Ozonoterapia como tratamento adjuvante na ferida de pé diabético. Revista Médica Minas Gerais. 20. 442-445.
Gracer, R.I, Bocci, V. (2005). Can the combination of localized proliferative therapy” with “minor ozonated autohemotherapy” restore the natural healing process. Medical hypotheses.65. 752-759.
Naglik Jr., Challacombe J., Hube B. (2003). Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and molecular biology reviews. 67. 400-428.
Pereira, M. M, Navarini A., Mimica L. M. J., Pacheco Jr., Monteiro, A., Silva, R. A. (2005). Efeito de diferentes gases sobre o crescimento bacteriano: estudo experimental "in vitro". Revista do colégio brasileiro de cirurgiões. 32. 12-14.
Traina, A. A. (2008). Efeitos biológicos do ozônio diluído em água na reparação tecidual de feridas dérmicas em ratos. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo.
Yano, J., Fidel, Jr., P.L. (2011). Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis. Journal of Visualized Experiments.



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