Dosagem das bilirrubinas



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Procedimento Operacional Padrão

DOSAGEM DAS BILIRRUBINAS

Página de

POPBIO 010

Revisão: 00




BILIRRUBINAS
FUNDAMENTO

A bilirrubina reage com o diazo reagente (ácido sulfanílico + nitrito de sódio), formando azobilirrubina de coloração vermelha, cuja absorbância medida em 525 nm é diretamente proporcional à concentração de bilirrubina na amostra.

A reação da bilirrubina direta (conjugada) ocorre em meio aquoso enquanto que a reação da bilirrubina indireta (não conjugada) requer a presença de um acelerador (benzoato + cafeína). A bilirrubina indireta é calculada pela diferença entre bilirrubina total e bilirrubina direta.
APLICAÇÃO CLÍNICA

A dosagem das bilirrubinas tem aplicação no diagnóstico e acompanhamento das icterícias.

As causas mais comuns de aumento da bilirrubina direta são as doenças hepatocelulares e as obstruções das vias biliares.

Valores altos de bilirrubina indireta ocorrem nas seguintes situações:

Quando há um aumento na produção de bilirrubina como nas diversas causas de hemólise.

Quando há uma diminuição no transporte da bilirrubina por ação de medicamentos e anticorpos.

Por defeito na captação da bilirrubina (deficiência ou bloqueio das lingandinas).

Por defeito na conjugação da bilirrubina (icterícia fisiológica do recém-nascido, doença de Gilbert, etc).


AMOSTRA

Preparo do Paciente


Colher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.

Amostras utilizadas

Soro e Plasma (heparina ou EDTA).



Estabilidade e armazenamento da amostra

Quando protegido da luz o analito é estável 2 dias entre 2-8°C.



Volume ideal utilizado para análise

(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise).


Volume mínimo utilizado para análise


(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise).

Critérios para rejeição da amostra

Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material.
REAGENTE UTILIZADO

BILIRRUBINAS CAT. 331 MS 80022230140

GOLD ANALISA DIAGNÓSTICA LTDA

CNPJ – 03.142.794/0001-16

Av. Nossa Senhora de Fátima, 2363

Belo Horizonte – MG – Brasil
Farmacêutica Responsável: Ludmilla Parreiras Campos CRF-MG 5463
Componentes do kit

Conservar em temperatura ambiente (15-25ºC).



1- Acelerador - Contém cafeína 130 mmol/L; benzoato de sódio 260 mmol/L; acetato de sódio 460 mmol/L e surfactante.
2- Sulfanílico - Contém ácido sulfanílico 5,8 mmol/L e ácido clorídrico 0,5 mmol/L.
3- Nitrito - Contém nitrito de sódio 72,5 mmol/L.
Estabilidade

Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminação durante o uso.




Reagente Não Fornecido

Padrão de Bilirrubina (Gold Analisa Cat. 332) –Reagente empregado na calibração periódica do Kit de Bilirrubinas.

Deverá ser adquirido separadamente.


Precauções e Cuidados Especiais

  1. Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.

  2. Recomendamos o uso das Boas Práticas de Laboratórios Clínicos para a execução do teste.

  3. De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.

  4. Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.



EQUIPAMENTOS


Procedimento Técnico Manual

  • Kit de Padrão de bilirrubina – Cat. 332 para a calibração;

  • Espectrofotômetro (leitura entre 500 e 540 nm);

  • Tubos e Pipetas;

  • Cronômetro.


Procedimento Técnico Automatizado

Citar nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento; Fazer referência ao manual ou POP para utilização do mesmo.


Procedimento Técnico Alternativo

Citar o equipamento alternativo e os procedimentos para medição dos ensaios. Indicar as possíveis diferenças quando os procedimentos manuais substituírem os procedimentos automatizados.


Procedimento em Analisadores Automáticos

Mencionar o manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes para o sistema automático.


Interferências

A hemólise (hemoglobina até 30 mg/dL) e lipemia (triglicérides até 170 mg/dL) não produzem interferências significativas.

Amostras com triglicérides acima de 170 mg/dL produzem resultados falsamente diminuídos.

Amostras muito hemolisadas (hemoglobina acima de 30 mg/dL) produzem resultados falsamente elevados de bilirrubina total e falsamente diminuídos de bilirrubina direta.


Preparo do Diazo Reagente

Misturar 50 µL do Nitrito (3) com 1,5 mL do Sulfanílico (2).

Usar no dia da preparação.



Atenção

Os volumes dos reativos podem ser modificados proporcionalmente.



PROCEDIMENTO


Procedimento Técnico Manual

Determinação do Fator de Calibração

Atenção

Para a calibração é necessário empregar o Kit de Padrão de Bilirrubina Cat. 332. Preparar o Padrão de acordo com as Instruções de Uso do produto Padrão de Bilirrubina (Gold analisa Cat. 332).

1- Dosar o Padrão de Uso em triplicata, da seguinte maneira:


Tubos

Branco

Padrão

Acelerador (1)

1000 µL

1000 µL

Sulfanílico (2)

100 µL

---------

Diazo Reagente

-------------

100 µL

Padrão de Uso

50 µL

50 µL

2- Homogeneizar bem e esperar 5 minutos na temperatura ambiente.

3- Determinar as absorbâncias do tubo Padrão em 525 nm ou filtro verde (500 a 540), acertando o Zero com o Branco.


Cálculos


Calcular o valor médio das absorções do Padrão e o Fator de Calibração (FC)

Cp = Concentração do Padrão = 10,0 mg/dL

FC = CP  AP

FC = 10,0  AP


Procedimento do Teste

A - Condições de Reação

Leitura: Comprimento de onda 525 nm (500 a 540 nm)

Medida: Acertar zero de absorbância com o tubo Branco

Tipo de Reação: Ponto final



B- Técnica de Análise

1- Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:







Branco

Direta (BD)

Total (BT)

Água deionizada

1000 µL

1000 µL

----------

Acelerador (1)

--------

---------

1000 µL

Sulfanílico (2)

100 µL

----------

-----------

Diazo Reagente

----------

100 µL

100 µL

Amostra


50 µL

50 µL


50 µL


2-Homogeneizar bem. Esperar 5 minutos na temperatura ambiente.

3-Determinar as absorbâncias das Bilirrubinas Direta e Total em 525 nm ou filtro verde (500 a 540), acertando o Zero com o Branco.

A cor é estável por 30 minutos.
CÁLCULOS

Obter os valores em mg/dL para a Bilirrubina Direta (BD) e Total (BT) utilizando o Fator de Calibração.

O valor da Bilirrubina Indireta (BI) é obtido pela diferença entre as Bilirrubinas Total e Direta.
CP = concentração do Padrão = 10,0 mg/dL

ABT = Absorbância da BT

ABD = Absorbância da BD

BT (mg/dL) = ABT × FC

BD (mg/dL) = ABD × FC

BI = BT – BD


Exemplo

CP = 10,0 mg/dL

Se AP = 0,342

Se ABT = 0,051

Se ABD = 0,032

FC = 10,0 ÷ 0,342

FC = 29,2

BT = 29,2 × 0,051 = 1,49 mg/dL

BD = 29,2 × 0,032 = 0,93 mg/dL

BI = BT – BD = 1,49 – 0,93 = 0,56 mg/dL



RESULTADOS


Conversão de Unidades

Unidade Convencional (mg/dL) × 17,1 = Unidade SI (µmol/L).



CONTROLE DA QUALIDADE

Materiais

Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e número de catálogo.

Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados.
Controle Interno

Descrever a calibração periódica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits.

Citar a utilização de soros controles (nível normal –código --------- e patológico –código -------) nas análises realizadas juntamente com a freqüência da utilização dos mesmos. Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e reagentes.

Citar POP para controle interno.



Controle Externo

Descrever os procedimentos utilizados nas avaliações de qualidade feitas por programas de comparação entre laboratórios ou outros controles de qualidade: PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC



Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo

Definir como os dados de controle são arquivados e gerenciados.

Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.

VALORES DE REFERÊNCIA


1-Adultos, adolescentes e crianças

Bilirrubina Total : até 1,2 mg/dL

Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL
2- Recém- nascidos – Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL
3- Recém- nascidos – Bilirrubina Total

1 dia: até 5,1 mg/dL

1 a 2 dias: até 7,2 mg/dL

3 a 5 dias: até 10,3 mg/dL


Estes valores devem ser usados como uma orientação. É recomendado que cada laboratório estabeleça seus próprios valores de referência.

SIGNIFICADO CLÍNICO


O metabolismo da bilirrubina inicia-se com a degradação das hemácias no SRE, em que a hemoglobina liberada é degradada em moléculas de globina e heme. O heme é então catabolizado para formar biliverdina, que é posteriormente transformado em bilirrubina.

A bilirrubina é portanto um composto tetrapirrólico formado no SRE através da degradação da hemoglobina. Esta forma de bilirrubina, denominada de bilirrubina não conjugada ou indireta circula na corrente sanguínea ligada à albumina. No fígado, essa bilirrubina indireta (não conjugada) é conjugada com o glicuronídeo, resultando na bilirrubina conjugada ou direta que é excretada do fígado para a bile e, através do ducto biliar comum atinge o segmento duodenal do intestino delgado.

A icterícia compreende a coloração visível dos tecidos pela bile e geralmente ocorre quando os níveis de bilirrubina atingem taxas acima de 2,5 mg/dL. As causas mais comuns de aumento da bilirrubina direta são as doenças hepatocelulares e as obstruções das vias biliares.

Valores altos de bilirrubina indireta ocorrem nas seguintes situações:

Quando há um aumento na produção de bilirrubina como nas diversas causas de hemólise.

Quando há uma diminuição no transporte da bilirrubina por ação de medicamentos e anticorpos.

Por defeito na captação da bilirrubina (deficiência ou bloqueio das lingandinas).

Por defeito na conjugação da bilirrubina (icterícia fisiológica do recém-nascido, doença de Gilbert, etc).




LINEARIDADE

A reação é linear até 25,0 mg/dL. Para valores maiores, diluir a amostra com solução de NaCL 150 mmol/L (0,85%) e realizar uma nova determinação. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição empregado.


LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Os resultados deverão ser usados em conjunto com informações disponíveis da avaliação clínica e outros procedimentos diagnósticos.



REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


1. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Fundamento de Química Clínica, 4ª Ed - Guanabara Koogan; 1998.

2. Henry RJ, Cannon DC, Wikelman JW. Clinical Chemistry, Principles and Technics, 2a Ed. New York, Harper & Row, 1974.

3. Jnedrassik, L. Biochem. Zentr., 297:81, 1938.

4. Malloy HT, Evelyn KA. J Biol Chem 1937;119:481.

5. Martineck RG Clin Chim Acta 1966;13:161.

6. Sims FH, Horn C. Am J Clin Path. 1958;29:412.



  1. BILIRRUBINAS, Instruções de Uso, Gold Analisa Diagnóstica.







Nome

Assinatura

Data

Elaborado por:







___/___/___

Aprovado por:







___/___/___

Implantado por:







___/___/___

Substitui POP:




Revisado por:







___/___/___

Revisado por:







___/___/___

Revisado por:







___/___/___

Desativado por:







___/___/___

Razão:







Número

Destino

Cópias











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