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Na prática clínica estes marcadores prognósticos são investigados pelo procedimento convencional de estudo fenotípico de linfócitos que utiliza a combinação de dois marcadores conjugados (ex. CD3/CD4, CD3/CD8 etc. ) e tradicionalmente usa vários tubos para análise. Este procedimento gera uma natural variação no resgate da população linfocitária, pela utilização de amostras distribuídas em vários tubos, além dos problemas de ambiguidade fenotípica conhecidos das populações linfocitárias que podem ocasionar erro na quantificação.

O painel usual recomendado é constituído de seis tubos utilizando CD14/CD45 para purificação do gatting de leucócitos, CD3/CD4 para a população de linfócitos T auxiliar, CD3/CD8 para os linfócitos T supressor/citotóxico, CD3/CD19 para distinguir população T da B e CD56/CD16/CD3 para distinguir NK da população T. Também existem combinações de três cores (CD3/4/8 e CD3/19/16), usando a mesma lógica.

Com os avanços da biologia molecular foi possível a produção de anticorpos monoclonais de alta especificidade, unindo cinco marcadores (CDs) ligados a três diferentes fluorocromos em uma única solução, permitindo a determinação simultânea de células T, B, Natural Killer e das subpopulações T CD4+ e CD8+. A análise por citometria de fluxo de cinco populações em um único tubo, atualmente representa a evolução metodológica. Desta forma é possível distinguir visualmente a distribuição integral e as populações linfóides, permitindo a correta identificação de cada uma delas, e ainda proporciona informação sobre subpopulações linfóides cuja relevância clínica não tem sido explorada até o momento, como CD3+CD4+CD8+, CD3+CD4-CD8-, CD3-CD56+(NK)CD8+ e CD3-CD56+CD8-.



Acompanhamento do Paciente Infectado pelo Hiv-1.

Regina Pardini - Instituto de Patologia Clínica Hermes Pardini , Belo Horizonte, MG.


A citometria de fluxo é um método analítico que permite a determinação quantitativa de populações e subpopulações celulares, utilizando anticorpos monoclonais marcados com corantes fluorescentes. O Instituto de Patologia Clínica Hermes Pardini utiliza a citomentria de fluxo principalmente para a contagem de linfócitos T e B, linfócitos T auxiliadores (CD4) e linfócitos T supressores (CD8).

A infecção pelo HIV-1 é caracterizada por uma diminuição lenta da contagem dos linfócitos T CD4. Os linfócitos T CD4 são as células envolvidas no reconhecimento inicial do antígeno apresentado pelos macrófagos e são responsáveis pela amplificação da resposta imune através da liberação de citocinas. Sendo assim, a destruição progressiva dos linfócitos T CD4 leva a uma susceptibilidade a doenças oportunistas que caracterizam o estágio final da doença, a AIDS.

O prognóstico dos indivíduos infectados pelo HIV é bastante variável. Nos adultos a média entre a infecção e o desenvolvimento da AIDS, ou seja, até o surgimento das infecções oportunistas, é de 10 a 11 anos. Uma significante proporção de indivíduos, cerca de 20%, evoluem rapidamente para a AIDS dentro de 5 anos. No outro extremo, estão os indivíduos que permanecem bem, livres de infecções oportunistas por mais de 10 anos, às vezes alcançando até 20 anos sem desenvolver a doença. Estes progressores lentos são cerca de 12% dos pacientes infectados.

Em geral, logo após a infecção ocorre um pequeno aumento da contagem de células CD4, que posteriormente cai pela metade no primeiro ano após a soroconversão. Estes valores permanecerão estáveis, dentro de um coeficiente de variação de 6 a 24% com relação aos valores percentuais e de 19 a 40/mm3 para os valores absolutos. Nos anos anteriores a progressão para AIDS ocorre uma destruição mais rápida de linfócitos T CD4, até um valor tão baixo que propicia o desenvolvimento de infecções oportunistas.

Segundo recomendações do centro de controle de doenças (CDC) o perfil fenotípico que deve ser utilizado para avaliar o sistema imunológico em pacientes infectados pelo HIV com maior reprodutibilidade e especificidade é a marcação tripla de antígenos celulares:
CD3/CD4/CD45
CD3/CD8/CD45
Controle
Existe uma grande variabilidade de resultados na contagem de dos linfócitos CD4, devido a :
1- TECNOLOGIA EMPREGADA:
A citometria de fluxo ® única metodologia aprovada pelo CDC, por várias razões:
- Exclui monócitos, que também contém antígeno CD4 na superfície de sua membrana
- Contagem de cerca 5000 células (enquanto a contagem manual avalia de 100 a 500 células, dependendo da metodologia utilizada)
- Possibilidade de realização de controle da contagem utilizando amostras liofilizadas de valor conhecido
- Leitura objetiva
2- FATORES QUE INFLUENCIAM A SUBTIPAGEM LINFÓCITÁRIA:
- Fatores biológicos: - Infecção intermitente aguda
- Uso de drogas ( AZT, cefalosporina, quimioterápicos, nicotina, corticosteróides, anticorpos anti-linfócitos humanos, etc. )
- Variação diurna ( a contagem é inversamente proporcional aos níveis de cortisol plasmático, podendo variar até 50% entre coletas feitas pela manhã e a tarde, em um mesmo dia). O sangue deve ser colhido até às 10 horas da manhã.
- Stress e exercício ( aumentam a marginalização dos linfócitos )
Todas estes fatores levam à diminuição do valor de células CD4.
- Erros intrínsecos ao procedimento: - Temperatura do espécime em trânsito ( a amostra deve ser sempre mantida à temperatura ambiente.)
- Demora na análise ( em EDTA a amostra deve ser testada até 36 horas após a coleta e em heparina até 48 horas)
- Hemograma (deve ser realizado até 6 horas após a coleta do material )
Estudos multicêntricos realizados em pacientes infectados pelo HIV-1 mostram que indivíduos com linfócitos CD4 acima de 24% ou 500/mm3, em geral tem um bom prognóstico. Apenas 16% destes indivíduos evoluirão para a AIDS em 3 anos. Cerca de 46% dos pacientes com contagens entre 200 a 500/mm3 desenvolverão AIDS em 3 anos. A grande maioria dos pacientes com valores de linfócitos CD4 menor que 14% ou 200/mm3 evoluirão para a AIDS em prazos mais curtos. Trabalhos posteriores mostraram que a velocidade da queda também é importante. Uma queda maior que 7% ao ano ou 80 células/mm3 é um sinal mais fidedigno de mau prognóstico.

Na realidade a contagem de CD4 passou a não refletir, pelo menos em determinadas fases da evolução da doença, a exata condição clínica do paciente, mostrando cifras elevadas diante de quadros clínicos avançados e vice-versa. Atualmente, a determinação da carga viral vem sendo considerada o melhor marcador isolado para o acompanhamento do paciente HIV positivo. Cerca de 62% dos pacientes com carga viral acima de 36000 cópias de RNA/ml de plasma evoluiram para a AIDS em 5 anos, em contraste com apenas 8% daqueles com contagens menores que 4000 cópias /ml.

A contagem de CD4 apesar de seu alcance sabidamente restrito, permanece um recurso útil para a avaliação do estado imune do paciente, existindo uma relação entre o risco de determinadas infecções e o número de linfócitos CD4. Está bem estabelecido que o risco de doença pulmonar por P.carinii e toxoplasmose é maior em pacientes com contagens menores de 200/mm3, e que a retinite por citomegalovírus e infecções disseminadas por micobactéria atípica é maior com contagens abaixo de 50/mm3. Sendo assim, o CDC preconiza a profilaxia primária destas infecções, aumentando a sobrevida e qualidade de vida nestes pacientes.

Atualmente associamos a dosagem da carga viral e contagem de CD4 para acompanhar os pacientes infectados pelo HIV-1. Apesar da relação entre esta duas determinações ser apenas razoável, ou seja, nem sempre uma contagem alta está relacionada a uma baixa carga viral e vice-versa, de acordo com as palavras do pesquisador John Coffin, citadas na revista Science, onde ele compara o desenvolvimento da AIDS com um trem em direção a um abismo, em que a carga viral indica a velocidade no qual o trem caminha para a catástrofe e o número de células CD4 sinaliza a distância do local do acidente.

Para avaliar a resposta ao tratamento, é importante saber que a contagem de CD4 aumenta muito pouco ou não aumenta em resposta a monoterapia com AZT. Já com relação aos inibidores da protease, potentes anti-virais, este aumento é maior, podendo alcançar até 100 células/mm3. A resposta ao tratamento está associado com o estado de imunodeprssão do paciente. Atualmente, o tratamento anti-viral dos pacientes infectados está indicado quando a carga viral é maior que 30000 cópias/ml ou quando está entre 5000 a 30000 cópias/ml associado a uma contagem de CD4 menor que 500/mm3.
Utilização da Citometria de Fluxo no Estudo do Mycobacterium tuberculosis, e suas Interações com o Sistema Imune

Maria da Gloria Bonecini de Almeida - Departamento de Imunologia e Hospital Evandro Chagas, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ.


Introdução. O Mycobacterium tuberculosis (Mtb) agente causador da tuberculose (Tb) infecta aproximadamente 1,7 bilhão de pessoas, correspondendo a um quarto da população mundial e cerca de 90.000 novos casos são identificados por ano no Estado do Rio de Janeiro (Programa Nacional de AIDS, 1996). Aproximadamente 20-25% dos casos de AIDS notificados ao Ministério da Saúde estão infectados pelo Mtb. A tuberculose é considerada uma das infecções mais comuns, de difícil tratamento e que encurta a sobrevida de indivíduos infectados pelo HIV-1 (Small P, N Eng J Med 324:289, 1991). Após a infecção, o indivíduo HIV-negativo apresenta risco de adoecimento entre 5-10%, durante sua vida; contudo, indivíduos HIV-positivos possuem um risco anual de 8% para contrairem tuberculose (Selwyn P, N Eng J Med 320: 545, 1989). Diversos aspectos da biologia do Mtb, bem como sua interação com as células hospedeiras - preferencialmente os macrófagos alveolares, e destas com linfócitos T CD4+ e CD8+, fazem parte da complexa geração de produtos secretados pelos bacilos, ao tentar escapar do sistema imune induzindo citocinas inflamatórias e pró-inflamatótias, serão brevemente descritos com os olhos da citometria de fluxo e os benefícios que este método trouxe para o entendimento da imunopatologia da tuberculose.

Identificação de marcadores protêicos na célula bacteriana. O arranjo espacial dos componentes da parede celular das micobacterias, leva a exposição de vários antígenos de superfície e possivelmente influenciará o reconhecimento antigênico e a interação bacilo-célula hospedeira. A identificação de antígenos protêicos/lipoprotêicos secretados ou liberados após a lise do Mtb na superfície do bacilo, bem como comparar a expressão destes antígenos com outras espécies do complexo tuberculose, poderá facilitar a identificação de possíveis alvos para o sistema imune e a realização de protótipos vacinais. O isolamento, caracterização bioquímica e a produção de anticorpos monoclonais direcionados contra estes antígenos, facilitados pelo uso da citometria de fluxo tem sugerido o reconhecimento na superfície dos bacilos de uma grande variedade de antígenos de Mtb já identificados (Ozanne V e cols., J Bacteriol 178:7254, 1996; Lefevre P e cols., J Bacteriol 179:2900, 1997; Harboe M e cols., Infect Immun 66:289, 1998).

Testes de susceptibilidade a drogas. Devido a rápida disseminação da Tb nos últimos 10 anos e ao surgimento de cepas resistentes à múltiplas drogas (MDRTB), esforços têm sido direcionados ao desenvolvimento de métodos rápidos para a determinação da susceptibilidade do Mtb aos agentes antimicobacterianos. Os métodos convencionais utilizados requerem crescimento dos bacilos, após isolamento, em meios contendo os agentes terapêuticos por 2 a 3 semanas ou a detecção de 14CO2 produzido pelo Mtb em crescimento, pelo menos por 1 semana. Recentemente, novos testes utilizando a citometria de fluxo estão sendo usados para identificar a susceptibilidade às drogas tuberculostáticas, utilizando-se cepas de laboratório (Norden e cols., J Clin Microb 33:1231, 1995), ou isolados clínicos (Kirk SM e cols., J Clin Microbiol 36:1568, 1998), após 24 h de cultivo. Assim, utilizando a capacidade de marcação do diacetato de fluoresceína (FDA) ao Mtb, estes autores demonstraram ser este um teste rápido e simples. Contudo, os resultados obtidos em culturas com microrganismos vivos são mais próximos aos testes convencionais, do que aqueles obtidos com microrganismos formolizados, necessitando assim, de laboratórios de segurança tipo P3 para sua execução. A possibilidade de utilização desta metodologia para a detecção de susceptibilidade a drogas também em micobactérias atípicas, tais como: M. marinum, M. gordonae e M. frotuitum foi demonstrada por Bownds SE e cols. (J Clin Microbiol 34:1386, 1996). Fluorocromos, como rodamina, fluoresceína e amarelo Lucifer, foram utilizados para a marcação de Salmonella, Listeria monocytogenes, M.avium e Mtb e posterior uso em citometria de fluxo (Drevets DA J Immunol Methods 16:187:69, 1995). Em geral os fluorocromos não afetam a viabilidade dos bacilos, nem a capacidade de serem fagocitados ou mesmo de se replicarem no interior dos fagócitos (Drevets DA J Immunol Methods 16:187:69, 1995), tornando assim este método útil para estudo da interação entre estes microrganismos e as células hospedeiras.

Interiorização na célula hospedeira. Macrófagos e neutrófilos polimorfonucleares alveolares são importantes na manutenção da homeostasia do sistema imune nos pulmões, bem como para manter o controle da replicação do Mtb. A infecção pelo Mtb inicialmente envolve a adesão aos fagócitos por processos opsônicos e não opsônicos, dentre estes mediados por receptores de manose. Assim, antígenos de Mtb manosilados são capazes de se ligar e interagir com fagócitos (Venisse A e cols., Eur J Biochem 231:440, 1995). A ativação da via clássica e alternativa do complemento após a infecção pelo Mtb é descrita como sendo um possível fator potencializador da atividade fagocítica de macráfogos, através da interação com os receptores de complemento nestas células. A demonstração, por citometria de fluxo, de que depósitos de complexos imunes, provenientes de soros de indivíduos tuberculosos, são capazes de se formar in vitro sobre o BCG, reafirma esta hipótese (Hetland G e cols., Clin Diagn Lab Immunol 5:211, 1998).

Alterações funcionais e ativação celular. Após ingestão dos Mtb pelos macrófagos alveolares, estas células iniciam seu processo de ativação celular, pela secreção de fatores quimiotáticos, que culmina na formação de uma resposta granulomatosa, importante para a resistência à tuberculose. A IL-8 é considerada um destes fatores quimiotáticos; entretanto, a regulação da expressão dos receptores para esta citocina encontram-se gradativamente diminuída em pacientes com tuberculose pulmonar ativa, HIV-1 e aqueles duplamente infectados, utilizando-se anticorpos anti-RIL-8 (CXCR-1 e CXCR-2). A determinação da atividade funcional destas células, através da determinação da atividade fagocítica e a produção de radicais de oxigênio (explosão respiratória), tem mostrado que ambas funções aumentam com o tempo de exposição/infecção dos macrófagos e neutrófilos ao Mtb. Recentemente Smits e cols. (Vet Immunol Immunopathol 56:259, 1997), descreveram a utilização de um método com dupla marcação, para identifiar estas duas funções básicas dos fagócitos. Este método utiliza a capacidade de oxidação intracelular da dihidroradamina 123 em rodamina fluorescente 123 por produtos da explosão respiratória, e a marcação simultânea com iodeto de propídio. Da mesma forma, Kuo e cols. (Tuber Lung Dis 77:468, 1996) descreveram que macrófagos alveolares de pacientes com tuberculose pulmonar ativa têm alta expressão de beta-2 integrinas (CD11a/CD18 e CD11b/CD18) e produção de H2O2. A produção de H2O2 foi detectada através do metabolismo intracelular de 2’7’diacetato de diclorofluoresceína e analisada por citometria de fluxo.

Poderíamos dispor de várias páginas para descrever a ativação e/ou desativação de monócitos/macrófagos, neutrófilos, células NK, linfócitos B, T CD4+ e CD8+ após a infecção pelo Mtb, e sua associação com outro parasita intracelular, como o HIV-1. Recentemente descrevemos que indivíduos portadores de tuberculose pulmonar ativa apresentam uma supressão periférica e alveolar medida pela diminuição de células T CD4+ e a incapacidade de responder a antígenos de Mtb in vitro (Bonecini-Almeida MG e cols., Cell Immunol, no prelo).



Apoptose. A apoptose é um processo que ocorre como parte da diferenciação, proliferação e crescimento de células normais e malignas. Embora evidências de apoptose em fagócitos mononucleares, tenham sido pouco relacionadas à sobrevivência de microrganismos intracelulares nestas células, recentemente diversos autores têm focado seu objetivo de estudo neste fenômeno. Assim, a morte celular programada é induzida em macrófagos humanos e murinos após infecção pelo M bovis Calmette-Guérin BCG (Molloy A e cols., J Exp Med 180:1499, 1994) e M. avium (Gan H e cols., J Immunol 155:1304, 1995). Esta capacidade esta diretamente relacionada à resistência (Bcgr) e susceptibilidade (Bcgs) das cepas de camundongos utilizadas (Rojas M e cols., J Immunol 159:1352, 1997).

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