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Neoplasias de células T e células NK periféricas



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Neoplasias de células T e células NK periféricas


  1. Leucemia linfocítica / leucemia prolifocitica cronicas de células T

  2. Leucemia de grandes linfócitos granulares

  3. Micose fungóide / S. de Sezary

  4. Linfoma de células T periféricas: subtipo provisórios:

Células médias, misto de células médias e grandes, células grandes, e células linfoepitelióides

  1. Linfoma de células T angioimunoblástico (AILD)

  2. Linfoma angiocentrico

  3. Linfoma de células T intestinal ( enteropatia associada)

  4. Leucemia / linfoma de células T do adulto (ATL/L)

  5. Linfoma de grandes células anaplásico (ALCL), CD30+, do tipo células T e “null”

10.Subtipo provisório: Linfoma de grandes células anaplásico, “Hodgkin’s-like”

Inclassificáveis



  1. Linfoma de células B inclassificáveis(baixo/alto gráu)

  2. Linfoma de células T inclassificáveis (baixo/alto gráu)

  3. Linfoma maligno, inclassificável

Imunofenotipagem dos LNH


Entre os exame complementares a morfologia, a imunofenotipagem consiste no mais importante deles, particularmente para utilizar a classificação mencionada acima.

O princípio da Imunofenotipagem reside na determinação do tipo de moléculas presentes na superfície, ou eventualmente no citoplasma das células linfomatosas. Isto é possível graças a disponibilidade de anticorpos que se ligam especificamente a essas moléculas, sendo por essa razão designadas de “antígenos”. Tais anticorpos são “ manipulados “ de diferentes maneiras, afim de que sejam “identificados” por diferentes metodologias .

As finalidades básicas da imunofenotipagem dos linfomas podem ser assim resumidas :


  1. definição de clonalidade.

  • Neoplasias de linhagem B - expressão de uma única cadeia leve Kappa ou Lambda pelas células neoplásicas.

  • Neoplasias de linhagem T - não dispomos de um marcador de igual credibilidade como a expressão de cadeias leves monotipicas para a linhagem B. Assim, utilizamos como critérios sugestivos de monoclonalidade:

A expressão aberrante de antígenos não observadas nas células normais.

  1. A deleção de antígenos próprios das células T.

  1. O auxilio na subclassificação dos linfomas.

A combinação da expressão de determinadores antígenos, quando correlacionada a interpretação morfológica, permite uma subclassificação muito mais acurada das diferentes entidades reconhecidas hoje e listadas na classificação REAL

Assim, o imunofenótipo pode nos informar por exemplo se um linfoma é de linhagem linfóide B, T ou NK, se tem um perfil de células imaturas ou maturas, ou ainda caracterizar determinados subtipos de linfomas com características biológicas próprias, e comportamento clínico particular.

A caracterização imunofenotípica dos linfomas pode ser realizada por 2 métodos na prática clínica: a imunohistoquímica (IH) em preparados citológicos ou em cortes de tecido, e a citometria de fluxo (CMF), em células em suspensão em um meio líquido.

Para a técnica da CMF os anticorpos são marcados com um fluorocromo, de tal forma que, se a célula exibir a molécula para a qual o anticorpo é dirigido, ao ser iluminada pelo feixe de luz laser, emitirá um pulso de fluorescencia o qual será detectado por um sensor específico para aquele comprimento de onda relacionado ao fluorocromo marcador; com os citometros que dispomos hoje nos laboratórios de rotina, é possível analisar-se simultaneamente 3 a 4 antígenos identificados com diferentes fluorocromos, além de ser possível a classificação das células de acordo com as suas características intrínsecas de tamanho e complexidade citoplasmática.

Vantagens da CMF:


  • Análise da expressào simultânea de até 4 diferentes antígenos na mesma célula.

  • Avaliação quantitativa rápida e acurada não só da proporção de células com um determinado fenótipo, assim como o reconhecimento de populações normais e anormais segundo a intensidade de expressão de determinados antígenos.

Desvantagens da CMF:

  • Necessita de material a fresco, com células viáveis

  • Não permite uma correlação direta com a morfologia.

No método IH , a revelação da reação baseia-se na utilização de reações enzima-substrato para converter cromógenos incolores em produtos finais com cor própria, que podem ser vizualizados através da microscopia óptica convencional. Utiliza-se em geral o método imunoenzimático indireto, através do qual um anticorpo secundário ou terciário é marcado com uma enzima (peroxidase, fosfatase alcalina), associadas a diferentes combinações substrato-cromógeno. Em cortes histológicos, a técnica pode ser realizada em material congelado, ou em material fixado em formalina e embebido em parafina. Esta última opção é a mais utilizada na maioria dos laboratórios, sendo hoje comercializados um grande número de anticorpos para esse fim.

Vantagens do método IH:



  • Pode ser realizado retrospectivamente a qualquer momento, orientado pelo exame morfológico.

  • Permite a correlação estreita entre a expressão dos antígenos e as características morfológicas das células que os expressam.

Desvantagens do método IH:

  • Quando realizada em material incluído em parafina, restringe o número de antígenos que podem ser analisados, em função da destruição ou bloqueio de epítopos antigênicos durante o processo de fixação e processamento do material.

  • Oferece possibilidades limitadas em relação a quantificação e avaliação da co-expressão de antígenos

  • Não permite a avaliação da intensidade de expressào antigenica

Para os linfomas, o fenótipo citogenético e molecular frequentemente se correlaciona com a morfologia e o imunofenótipo, sendo na maioria das vezes desnecessários os estudos citogenéticos e moleculares para o diagnóstico.

Estão apresentados nos quadros 2 e 3 os painéis considerados básico e complementar de marcadores úteis para o diagnóstico e classificação dos linfomas. Todos eles podem ser utilizados por IH ou CMF.

Nos LNH a imunofenotipagem é especialmente útil nas seguintes situações:

Diagnóstico diferencial das neoplasias de pequenas



Quadro 2: Painel básico para imunofenotipagem dos linfomas, em material embebido em parafina


Anticorpo


Células identificadas

CD45

Leucócitos, células L&H

CD20

Linfócitos B, células L&H, células RS +/-

CD79a

Células B, pré-B e plasmócitos

, 

Cadeias leves da imunoglobulina

CD3

Células T

CD45RO

Células T(memória), células mielóides

CD43

Células T, algumas células B, células mielóides

CD15

Granulócitos, células RS, monócitos

CD30

Células RS, imunoblastos, LAGC

MPO

Células mielóides

TdT

Linfoblastos

MIB-1

Células proliferantes

Bcl-2

L.folicular e outros l.de baixo gráu +/centro germinativo -

P80, ALK-1

LAGC

Células L&H: variante da célula RS do L.H. predominancia linfocitária

Célula RS: célula de Reed-Sternberg, diagnóstica do L.Hodgkin

LAGC: Linfoma anaplásico de grandes células.



Quadro 3: Painel complementar para a imunofenotipagem dos linfomas em material embebido em parafina


Anticorpo


Célula identificada

CD4, VD8

Subgrupo de células T

CD5 (4C7)

Células T, LLC, LCM

CD1a

Células de Langerhans, timócitos corticais

TIA-1, perforina, granzyme B

Células T citotóxicas, células NK

IgD

Células do manto, LCM

CD21

CDF

CD23

CDF, LLC

Ciclina D1

LCM

LMP-1

Proteína latente da membrana do EBV

EMA

LAGC, plasmócitos, células L&H

P53

Relacionado a progressão para l. de alto grau

LLC: leucemia linfóide cronica/linfoma linfocítico de pequenas células

LCM: Linfoma de células do manto

CDF: Células dendríticas foliculares

LAGC: Linfoma anaplásico de grandes células




  • células, nos pacientes pediátricos (linfoma, vs neuroblastoma vs rabdomiosarcoma embionário vs s. Ewing/PNET), onde a positividade para o CD45 é patognomonica da linhagem hematolinfóide. Lembrar entretanto que os linfomas de células precursoras podem ser negativos para o CD45, particularmente pelo método IH.

  • Caracterização da linhagem da neoplasia: B vs T vs mielóide, fundamental para se estabelecer o prognóstico e tratamento. A morfologia apenas não fornece subsídios para esse objetivo

  • Diagnóstico diferencial entre L. anaplásico de grandes células e L. Hodgkin. No LAGC as células são CD20-,EMA+/-,CD15-,CD30+,AgT+/-, enquanto no LH clássico, as células atípicas exibem o imunofenótipo CD20-,EMA-, CD15+ e CD30+

  • Como auxiliar na subclassificação dos linfomas de baixo gráu do adulto, como o demonstra o quadro 4

  • Definição de clonalidade nos casos de diagnóstico diferencial difícil entre um processo reacional vs linfoma. No caso de linhagem linfóide B, o diagnóstico de clonalidade pode ser estabelecido pela expressão pelas células neoplásicas de uma única cadeia leve da imunoglobulina. A CMF é o método indicado para este fim, sendo os resultados obtidos pelo método de IH em material incluído em parafina muito ruins, só sendo útil na prática quando as imunoglobulinas estão localizadas no citoplasma, como ocorre nos plasmócitos, ou nos linfócitos plasmocitóides. No caso de linhagem T, novamente a CMF é o método de escolha, uma vez que a clonalidade pode ser inferida apenas por um perfil imunofenotípico aberrante, como a co-expressão de CD4 e CD8 pela mesma célula, ou a deleção de um ou mais marcadores pan-T, ou mesmo a expressão aberrante de um marcador de linhagem B ou mielóide, não habitualmente encontrado nas células T normais

CITOMETRIA DE DNA


A citometria de DNA pelo método de CMF é um método simples e rápido de se detectar clones de células com anormalidades cromossômicas, através da determinação de seu conteúdo de DNA nuclear. Embora exista uma boa correlação com os métodos de citogenética, a sensibilidade do mesmo só permite se detectar um clone anormal quando a alteração no conteúdo do DNA for da magnitude de pelo menos 2 cromossomos grandes.

As principais vantagens deste método são:



  1. A possibilidade de se detectar de forma rápida e simples populações clonais aneuplóides

  2. A infomação concomitante da atividade proliferativa da população celular de interesse através da determinação da fração de células na fase S do ciclo celular (SPF)

As implicações clínicas desses resultados na avaliação dos linfomas poderiam ser assim resumidas:

  1. Em situações de dúvida entre um processo reacional benigno e uma neoplasia a demontração de um clone aneuplóide nas doenças oncohematológicas é indicativo de malignidade.

  2. No acompanhamento de pacientes com neoplasia aneuplóides, é um método bastante sensível para a deteccão de recidiva e de doença residual.

  3. Pode servir como método auxiliar nos casos de dúvida entre um linfoma de baixo ou alto gráu, uma vez que existe uma boa correlação entre aneuploida e linfomas de alto gráu. Da mesma forma a atividade proliferativa apresenta excelente correlação com o gráu de malignidade (Quadro 5).

Merece ser destacada a extrema utilidade no diagnóstico do L. de Burkitt onde a SPF é surpreendentemente elevada, em geral acima de 30%, caracterizando de forma significativa essa neoplasia em relação ao diagnóstico diferencial com outras neoplasias hematopoiéticas ou não hematopoiéticas

Pode se revestir de importante significado prognóstico como por exemplo no caso dos mielomas, onde a atividade proliferativa é hoje considerada como variável prognóstica independente.


Quadro 4: Perfil imunofenotípico das linfoproliferações crônicas de baixo grau

Imunofenótipo

LLC/LLPC

LECV

LF

LCM

LGC

Intensidade IgM

Fraca

Forte

Forte

Forte

Forte

CD5

++

-/+

-/+

+

-/+

CD23

++

+

+

-/+

-

FMC7

-/+

++

+

+

+

CD22 m

-

++

+

+

+

CD10

-/+

+

+

-/+

-/+

LLC/LLPC: leucemia linfóide crônica/linfoma linfocítico de pequenas células

LEVC: linfoma esplênico de células vilosas

LF: linfoma folicular

LCM: linfoma de células do manto

LGL: linfoma de grandes células


Quadro 5: Correlação entre grau de malignidade e atividade proliferativa avaliada pala fração de células na fase S (SPF) nos linfomas não Hodgkin

SPF/ Grau

Baixo Grau

Grau

Intermediário



Alto grau



SPF

<5%

5-15%

>15%

Leitura recomendada:



  1. Sandlund JT, Downing JR, Crist WM. Non-Hodgkin lymphomas in childhood. N Engl J Med 1996;334 (19):1238-1248.

  2. Non-Hodgkin lymphoma pathologic classification project. National cancer Institute sponsored study of classification of non-Hodgkin lymphomas: summary and description of a Working Formulation for clinical usage. Cancer 1982;49:2112-2135.

  3. Harris NL, Jaffe ES, Stein H, et al. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood 1994;84:1361-1392.

  4. A predictive model for aggressive non-Hodgkin lymphoma. The International Non-Hodgki’s Lymphoma Prognostic Factors Project. N Engl J Med 1993;329:987-994.

  5. A clinical evaluation of the international lymphoma study group classification of the non-Hodgkin lymphoma. Blood 1997;89:3909-3918.



Mesa Redonda 6 – Citometria de Fluxo no Estudo da AIDS

Citometria de Fluxo na Avaliação Imunológica de Indivíduos Infectados pelo HIV. -

Mariza G. Morgado & Ivan Neves Jr. - Laboratório de AIDS e Imunologia Molecular. Dept. de Imunologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.


A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana HIV leva a um profundo estado de imunossupressão, caracterizado pela progressiva redução da população de linfócitos T CD4+. Este achado foi rapidamente incorporado a clínica e a quantificação destas células tem se mostrado de grande relevância no acompanhamento de pacientes infectados pelo HIV, como um marcador de evolução para a AIDS, assim como para a introdução de terapia antiretroviral e profilática de infecções oportunistas (Stites et al. 1989, Clin. Immunol. Immunopathol., 52:96-103; Bogner & Goebel 1991, Infection 19: S103-S108; Fauci et al. 1993, Science 262: 1011-1018).

A citometria de fluxo é a metodologia de escolha para este tipo de análise, pois permite a quantificação específica de subpopulações celulares através do uso de anticorpos monoclonais específicos, além de ser uma metodologia semi-automatizada, permitindo o processamento e leitura de um grande número de amostras. Os avanços nesta área são crescentes, com a possibilidade, entre outras, de se definir em uma única amostra a área dos linfócitos, o percentual de linfócitos T e das subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+, através do uso de anticorpos monoclonais específicos e análise citofluorométrica utilizando três ou quatro cores distintas, o que facilita em muito a rotina laboratorial e os protocolos de pesquisa. Neste tipo de análise o volume de sangue necessário é mínimo (100 ul) facilitando a avaliação imunológica dos pacientes, principalmente, nos casos de AIDS pediátrica.

Se por um lado a avaliação dos linfócitos T CD4+ por citometria de fluxo já se encontra perfeitamente incorporada a clínica, a análise de outras populações linfocitárias, caracterizadas por um extenso painel disponível de anticorpos monoclonais, que permite definir subpopulações celulares relevantes na definição do status imunológico de indivíduos infectados pelo HIV, ainda se encontra restrita aos protocolos de pesquisa. Desde o início dos estudos imunológicos de pacientes infectados pelo HIV tem se verificado que os linfócitos T CD8+ encontram-se aumentados tanto em valores absolutos como percentuais, observando-se uma contínua inversão da relação CD4+/CD8+ ao longo da evolução para a AIDS. Além disso observa-se um aumento progressivo da subpopulação de linfócitos CD8+ ativados, com aumento da expressão de HLA DR e CD38, que apresenta uma correlação positiva com a evolução para a AIDS (Kestens et al. 1992 AIDS 6: 793-797). Por outro lado, em função de sua atividade citotóxica, produção de beta-quimiocinas (MIP-1a, MIP-1b e RANTES) e de fatores limitantes da replicação viral (CAF) torna-se de grande importância da avaliação quantitativa e qualitativa de linfócitos T CD8+ na infecção pelo HIV (revisto por Garzino-Demo et al. 1998 AIDS Res Hum Retrov, 14: S177-S184).

A introdução recente de novas terapias antiretrovirais combinadas tem se mostrado altamente eficiente na redução da carga viral e, consequentemente, no aumento do número de linfócitos T CD4+ de indivíduos infectados pelo HIV. Este fato tem suscitado discussões importantes no sentido de se determinar a capacidade de restauração do sistema imune de indivíduos submetidos a terapia antiretroviral, principalmente daqueles que iniciam a terapia já em um estado avançado de imunossupressão. Assim, o acompanhamento imunológico destes pacientes mostra uma elevação gradativa da população de linfócitos T CD4+ e redução da população de linfócitos T CD8+, associados à redução dos níveis plasmáticos de RNA viral, sem, no entanto, atingirem os níveis de normalidade (Autran et al. 1997, Science 277:112-116). Além disso, a avaliação de diferentes marcadores de superfície de linfócitos T CD4+, mostra que esta elevação é, principalmente, devido ao aumento de células de memória CD45RO+ logo nos primeiros meses após a introdução da terapia antiretroviral, enquanto que a população de células não primadas (CD45RA+) encontra-se diminuída. Reduções nos percentuais de linfócitos T ativados CD4+DR+, CD45RO+DR+, CD8+DR+ e CD8+38+ são também observadas em decorrência da resposta à terapia antiretroviral. No seu conjunto, estes dados sugerem que a redução da replicação viral pode levar à reversão das alterações imunológicas verificadas na AIDS, reforçando a importância da análise continuada destes parâmetros em indivíduos infectados pelo HIV.

Desde 1990 nosso Laboratório vem utilizando a citometria de fluxo no acompnhamento imunológico de indivíduos infectados pelo HIV, incorporando os avanços introduzidos nesta metodologia. Ao longo destes anos a quantificação da população de linfócitos TCD4+ tem sido utilizada na definição do status imunológico e classificação dos pacientes de acordo com os critérios do CDC (CDC 1994, MMWR 43, No. RR-3), orientando a conduta clínica e permitindo a utilização destes dados no sentido de avaliar a distribuição temporal de variantes virais circulantes no Brasil (Morgado et al. 1994, AIDS Res. Hum Retrov., 10: 569-576; Morgado et al 1996, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 91: 339-342; Morgado et al 1998, J. of Acq. Immun. Def. Synd. & Hum. Retrov., in press); na avaliação da importância do status imunológico dos pacientes na transmissão do vírus (Guimarães et al. 1995, Am.J.Epidemiol.,142: 538-547; Guimarães et al. 1995, Arch. Int. Medicine, 157: 1362-1368); e em estudos in vitro de imunomodulação com o zinco (Neves Jr et al. 1994, Cytometry, 7: 26; Neves Jr et al. 1998, Clin. Exp. Immunology, 111:264-268).

Mais recentemente, estamos procedendo a um estudo longitudinal, acompanhando a evolução de diversas subpopulações celulares em pacientes infectados por diferentes subtipos de HIV-1 prevalentes no Brasil, no sentido de avaliar a influência da diversidade viral na imunopatogenia da infecção pelo HIV e na resposta à terapia antiretroviral. Por outro lado, uma questão de grande relevância a atualidade é saber como o sistema imunológico se reconstitui frente a redução da carga viral decorrente do uso combinado de potentes antiretrovirais. Neste protocolo, além da avaliação das subpopulações linfocitárias, de linfócitos T ativados e de células em apoptose, estamos analisando também a expressão de moléculas co-estimulatórias, como CD80 e CD86 e CD28, no sentido de avaliar a reversão da regulação negativa destas moléculas em decorrência da resposta à terapia antiretroviral.



Citometria de Fluxo no Estudo da AIDS

Francisca Gonçalves de Carvalho – Setor de Imunopatologia, Laboratório Dr. Sérgio Franco, Rio de Janeiro, RJ.


A imunofenotipagem de populações linfocitárias é de grande utilidade clínica e tem valor prognóstico e terapêutico em diferentes patologias: permite a quantificação de células T CD4+ em pacientes com HIV+, o estudo e classificação de doenças autoimunes e o monitoramento pós-transplante e de precursores hematopoiéticos no estudo das neoplasias.

Na imunodeficiência associada ao HIV ocorrem alterações do sistema imune que se expressam pela diminuição contínua de linfócitos CD4 e nas várias fases da doença também ocorrem alterações das populações CD3+CD8+, CD19 e NK, com conseqüente diminuição da função linfocitária, da proliferação celular, das citocinas liberadas por T auxiliar e da atividade citotóxica. Estas alterações celulares constituem bons marcadores prognósticos para a infecção pelo HIV e portanto devem ser específicos da progressão da doença e não devem ser encontrados em condições normais; além disso devem ser sensíveis para determinar o curso da infecção e preditivos da resposta clínica à terapia.




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