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Encerramento


Palestra de Abertura

Os Primórdios e a Expansão da Citometria de Fluxo no Brasil

Sérgio G. Coutinho - Chefe do Laboratório de Imunidade Celular e Humoral, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ.


Em novembro de 1988 foi instalado no Instituto Oswaldo Cruz, o primeiro citômetro de fluxo da América Latina, entrando em funcionamento logo a seguir. Entretanto, a idéia da utilização desta potente ferramenta para análises multiparamétricas, célula por célula ou de cada microorganismo individualmente, contidos em populações heterogêneas, era mais antiga. No período de 1979/1980 estávamos no WHO Immunology Research and Training Centre em Lausanne, Suíça, trabalhando em resposta imune mediada por linfócitos T, de camundongos infectados por Leishmania. Utilizávamos freqüentemente a análise citofluorimétrica do fenótipo das populações celulares, respondedoras aos antígenos parasitários, o que nos trouxe a imediata percepção das extraordinárias vantagens que o método proporcionava, em termos de rapidez e precisão, para o estudo dos mais variados aspectos da biologia celular. Abria-se um amplo leque de possibilidades para sua utilização, permitindo ainda saltos importantes na qualidade das investigações.

Com o intuito de aumentar a divulgação da referida metodologia em nosso meio, sugerimos que um dos artigos científicos gerados durante aquele período em Lausanne, fosse aqui publicado. Assim sendo, o artigo: “Functional analysis of the murine T lymphocyte immune response to a protozoan parasite, Leishmania tropica”. Engers H.D., Coutinho S.G., G.M. Araujo Lima & J.A. Louis. Mem.Inst.Oswaldo Cruz 78: 105-120, 1983 foi, ao que nos conta, o primeiro trabalho publicado em periódicos da América do Sul, em que se utilizava a análise citofluorimétrica de populações celulares.

Já de volta ao Brasil, e após iniciarmos no Instituto Oswaldo Cruz, nossas investigações em imunologia celular em pacientes com leishmaniose tegumentar americana, abordávamos com os dirigentes da Instituição, sempre que havia oportunidade, o assunto referente à necessidade de introduzir a citometria de fluxo em nosso meio. Salientávamos suas vantagens e o amplo e variado campo de investigação que se abriria. O principal problema referia-se sempre aos recursos financeiros, já que postulávamos por um equipamento de ponta, e portanto de custo elevado. Em 1987/88, o então Diretor do IOC, Dr. Carlos Morel, conseguiu com a Presidência da Fiocruz uma composição financeira, em que incluía recursos da FIOCRUZ e também da Previdência Social, completando assim o valor necessário para a compra. Foi constituída uma comissão composta pelos pesquisadores do IOC Sergio G. Coutinho, Henrique Kriger, Henrique Lenzi, Samuel Gondenberg e Ricardo Ribeiro dos Santos, com a finalidade de definir as características e a configuração do equipamento a ser adquirido, já que se destinaria tanto às atividades de investigação científica, como à prestação de serviços, estando ainda aberta sua utilização, também a Instituições outras, que não a FIOCRUZ.

Esta comissão manteve-se ativa, mesmo após a instalação do aparelho em nosso laboratório no IOC, agora com a competência para definir as prioridades, entre as inúmeras solicitações para utilização que chegavam, vindas tanto da própria Instituição, como de Universidades no Rio de Janeiro e de outros Estados, como São Paulo, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, além de outros. Em termos de serviços, os mais importantes eram aqueles referentes ao acompanhamento de pacientes aidéticos e os provenientes do Instituto Nacional do Câncer .

A citometria de fluxo estava assim implantada e amplamente utilizada, preenchendo seus objetivos previamente definidos, na esfera científico-tecnológica e social, e ainda aberta para o aprendizado e treinamento de recursos humanos, tanto de pessoal da própria Instituição, como de outros Centros. Disciplinas da pós-graduação foram organizadas, incluindo treinamento nesta área.

O caráter aberto, nada hermético de sua utilização, ficou bem caracterizado, quando os primeiros trabalhos publicados utilizando o citômetro de fluxo do IOC, foram provenientes tanto de nosso laboratório, como de grupos de pesquisa de outras Instituições (respectivamente “Analysis of the human T cell responsiveness to purified antigens of Leishmania: lipophosphoglycan (LPG) and glycoprotein 63 (gp63)”. Mendonça S.C.F., Russell D.G., Coutinho S.G.; Clin. Exp. Immunol., 83: 472-478, 1991 e “Acute Trypanosoma cruzi infection differencially affects CD3 and Thy-1 cell activation”. Oliveira G.A. & Gattass. C.R.; Immunology Letters, 28: 227-232, 1991.

Nestes 10 anos, foi impressionante a expansão da citometria de fluxo na FIOCRUZ e no Brasil. Só no IOC, hoje existem em funcionamento três destes equipamentos, sendo que um novo está sendo adquirido, para substituir aquele primeiro, já obsoleto após estes anos. Para esta nova aquisição foi fundamental a decisão do atual Diretor do I.O.C., Dr. J. Rodrigues Coura e o apoio do Programa de Citometria de Fluxo da FIOCRUZ, recentemente criado. Este Programa se fez necessário, para otimizar e incentivar a cooperação entre os diversos grupos que trabalham no assunto na FIOCRUZ, já que equipamentos semelhantes já existem em Far-Manguinhos e nos Centros de Pesquisas Renê Rachou, em Belo Horizonte e Gonçalo Muniz, em Salvador.

Universidades e Centros de investigações em vários Estados do País, adquiriram competência na especialidade.

O crescimento, como não podia deixar de ser, estendeu-se à iniciativa privada, haja vista a importância do método no diagnóstico e acompanhamento de diversas afecções, entre as quais as que comprometem o sistema imune e as de caráter neoplásico.

Foi criado o Clube de Citometria de Fluxo, já em sua VI Reunião em 1997. Também naquele ano foi fundada a Sociedade Latino Americana de Citometria de Fluxo e realizado o I Congresso Ibero-Latino Americano de Citometria de Fluxo no Guarujá, São Paulo.

Como se percebe, em 10 anos, o avanço foi imenso, sendo o sentimento de todos, o de um grande bem estar, por estarem participando deste vertiginoso progresso.

Mesa Redonda 1 – Impacto da Introdução da Citometria de Fluxo no Desenvolvimento Institucional.

10 Anos da Citometria de Fluxo no Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ

Álvaro Luiz Bertho – pesquisador responsável pela Citometria de Fluxo no Lab. de Imunidade Celular e Humoral, Dept. de Protozoologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ.


A introdução da citometria de fluxo no Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ ocorreu em novembro de 1988, com a chegada do primeiro citômetro de fluxo na América Latina, um EPICS 751 da Coulter Electronics. Após longo e dedicado esforço do Dr. Sérgio Coutinho para a implantação desta tecnologia em nosso meio científico, coube a mim a imensa responsabilidade da coordenação da utilização e o aprendizado da operação deste equipamento.

Alguns requisitos básicos para a instalação do citômetro, a resolução de problemas com o sistema auxiliar de refrigeração, e o treinamento, iniciado previamente nos EUA., principalmente em relação à separação de células (sorting) e à clonagem, se fizeram necessários depois que o sistema foi completamente instalado. Assim, o equipamento foi definitivamente liberado para utilização em março de 1989.

Com a divulgação, a nível nacional, da chegada desta nova tecnologia no Instituto Oswaldo Cruz, vários laboratórios da FIOCRUZ e de outras instituições enviaram pedidos para a utilização do equipamento. Departamentos do IOC como os de Protozoologia, Imunologia, Hanseníase e Virologia e outras instituições de pesquisa como a UFRJ, o INCA, o Instituto Butantan, a UFRGS, USP, INCOR-SP, a UERJ, a UFF e os outros centros regionais da FIOCRUZ, em Belo Horizonte e Salvador, enviaram seus projetos nos quais se fazia fundamental a utilização da citometria de fluxo para a realização dos mesmos.

O início foi muito difícil, já que era necessária a padronização de novas metodologias e poucas eram as pessoas a quem se pudesse recorrer para tirar nossas dúvidas tanto de cunho operacional como das possíveis aplicações de tal tecnologia. O suporte da Coulter do Brasil apesar de sempre disponível era, como nós, bastante inexperiente. Por outro lado, o convívio com alguns profissionais que se utilizavam desta tecnologia no exterior e a troca de experiências foi fundamental para o aprimoramento e o crescimento desta ciência em nossa Instituição.

Todos os projetos nos proporcionaram a oportunidade de aprender, estabelecer e adaptar várias técnicas citofluorimétricas necessárias para a realização dos mesmos. Dentro destas técnicas, gostaria de salientar a padronização das imunofenotipagens de duas ou três cores em células obtidas de pacientes de leishmaniose, doença de Chagas, hanseníase, AIDS, dengue entre outras; determinação de morte celular (apoptose e necrose) utilizando o iodeto de propídeo e a 7-AAD em células de lesão de pacientes de leishmaniose, em células estimuladas “in vitro” de pacientes HIV+ e em células de pacientes acometidos pela malária; mensuração do potencial de membrana de mitocôndrias em células de anfíbios utilizando a Rodamina 123, a determinação de cepas de Leishmania resistentes à múltiplas drogas (MDR); a determinação da expressão superficial da GP 57/51 no T.cruzi e a determinação de lectinas de superfície neste parasita; o estudo da relação macrófago-Leishmania pelo aumento da granularidade dos macrófagos; estudo do ciclo celular com PI e BRDU; análise da resposta celular de linhagens murinas selecionadas quanto a sensibilidade, resistência e a tolerância imunológica; e mais recentemente a adaptação da técnica de marcação intracelular de citocinas em células sangüíneas de pacientes de leishmaniose.

Além de todas essas técnicas de análise estabelecemos procedimentos de “sorting” de células e clonagens de parasitas, que auxiliaram vários laboratórios à realizar estudos biológicos e bioquímicos a partir de clones de várias espécies de parasitas, como Leishmania, T.cruzi, e Chritidia e, ainda, estudar fenômenos imunológicos utilizando populações de células (p.ex. células "nurse"; linfócitos T /+) purificadas a partir de amostras heterogêneas.

Com toda essa experiência, pudemos assumir toda a rotina de pacientes aidéticos do Hospital Evandro Chagas ate meados de 1994, quando o Lab. de AIDS adquiriu um outro citômetro de fluxo.

Devido ao grande número de usuários que nos solicitavam diariamente, tornou-se necessária a vinda de pelo menos mais uma pessoa para ajudar em nossa rotina. Foi quando, em 1990, a bióloga Marta Santiago, então estagiária de iniciação científica, chegou ao nosso laboratório, sendo de vital importância para que pudéssemos continuar com o padrão de nossos serviços. Desse momento em diante, após um período de ensinamento, nos revezávamos na utilização e coordenação da citometria de fluxo em nosso laboratório.

Precisava-se ainda, da aquisição de outros equipamentos tendo em vista uma demanda cada vez maior. Assim, em meados de 1996 chegou um citômetro de fluxo, da marca Beckton and Dickinson, que foi instalado no Laboratório de Biologia Celular do Dept. de Ultraestrutura e Biologia Celular, que ficou sob a responsabilidade da Dra. Tânia de Araújo Jorge.

Com três citômetros de fluxo funcionando intensamente, o Instituto Oswaldo Cruz podia oferecer um serviço mais adequado e trocar experiências para a melhoria de nossos conhecimentos. Além disso, podia-se recorrer a um outro equipamento caso o original apresentasse algum problema. Problemas? Problemas sempre existiram; alguns de fácil solução, outros demorados, como a troca do LASER, que levou 10 meses, devido a entraves burocráticos de importação. Porém, de uma maneira geral, o nosso equipamento neste 10 anos de utilização teve um aproveitamento exemplar.

Assim, com um funcionamento diário, o nosso citômetro de fluxo foi utilizado em 44 projetos de pesquisa da FIOCRUZ e em 27 projetos de pesquisa de outras instituições nacionais. Estes estudos proporcionaram a publicação de 28 artigos científicos em revistas indexadas, além de 53 trabalhos apresentados em congressos nacionais e internacionais, e 23 teses de mestrado ou doutorado defendidas. Números que para muitos podem ser inexpressivos mas, com certeza, traduzem a importância desta tecnologia nos diversos campos da pesquisa científica.

Atualmente, o nosso citômetro de fluxo continua sendo utilizado abertamente por todo o nosso meio científico, proporcionando, ainda, trabalhos em colaboração com laboratórios da FIOCRUZ e de fora dela. Mesmo assim, existe a necessidade de renovação e investimentos tanto na aquisição de um equipamento mais moderno como no treinamento de pessoal qualificado para operá-lo. Para isso, o Instituto Oswaldo Cruz está adquirindo um citômetro de fluxo de última geração, mais atual e com maior recurso de análise e com "sorting" e "cloning" mais rápidos e eficientes, e que estará, disponível aos diversos usuários das várias instituições de pesquisa científica.

Tudo isso, nos dá força para continuarmos a nos dedicar, ainda mais, a essa ciência que tem muito a nos servir e a nos ensinar.

Pelo menos por mais dez anos.



O Impacto da Citometria de Fluxo nos Trabalhos Desenvolvidos no Centro de Pesquisas René Rachou

Rodrigo Corrêa-Oliveira - Pesquisador Titular, Chefe do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisas René Rachou - FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG.


O Laboratório de Imunologia Celular e Molecular -LICM- do Centro de Pesquisas René Rachou -CPqRR- vem, há 6 anos, desenvolvendo trabalhos de pesquisa dependentes da utilização de citometria de fluxo. As atividades dos laboratórios do CPqRR, nesta área, tem produzido um número significativo de trabalhos científicos e teses que utilizam este aparelho e metodologia. O CPqRR tem atualmente 13 laboratórios trabalhando em diferentes aspectos das doenças parasitarias, principalmente esquistossomose, doença de Chagas, malária e leishmaniose. Dos 13 laboratórios 5 utilizam rotineiramente o citômetro de fluxo. O aparelho do LICM tem sido utilizado amplamente não somente por esses laboratórios, mas também por pesquisadores de outras instituições como o ICB e Faculdade de Medicina da UFMG, UENF e Hemominas. Além de sua utilização em estudos de populações celulares, mais recentemente temos avaliado e produzido trabalhos em parasitologia, estudando a reatividade de anticorpos a protozoários vivos e fixados.

O LICM do Centro de Pesquisas René Rachou, foi pioneiro em Belo Horizonte na implantação e utilização da metodologia de Citometria de Fluxo. A aquisição de um FACScan, através de um programa integrado de pesquisa financiado pelo ICIDR/NIH, permitiu que o LICM realizasse de forma pioneira as primeiras investigações de parâmetros fenotípicos celulares do sangue periférico de pacientes portadores de Esquistossomose mansoni e Doença de Chagas. Inicialmente, eram analisadas as populações e sub-populações celulares presentes ex vivo sem estímulo antigênico. Posteriormente, passamos a avaliar as populações celulares que proliferavam após o estimulo antigênico, para a investigação de marcadores de ativação celular, incluindo mais tarde a detecção de citocinas intracitoplasmáticas e morte celular passaram também a ser avaliadas. Com o aumento do número de anticorpos disponíveis, passamos a avaliar um número maior de parâmetros.

Empregando a metodologia de análise simultânea de quatro parâmetros celulares (tamanho, granulosidade, emissão de fluorescência verde, e emissão de fluorescência vermelha), o FACScan do LICM gerou uma grande quantidade de dados que resultou em 2 teses de Mestrado e 3 de Doutorado. Foram apresentadas até o momento 56 trabalhos em congressos no Brasil e 12 no Exterior. Estes estudos geraram ainda 15 publicações de artigos científicos em revistas indexadas de impacto e um capítulo de livro.

Atualmente, considerando-se o nível de evolução dos conhecimentos na área da Imunologia, a análise de apenas quatro parâmetros não produz informação suficiente para identificação de populações e subpopulações celulares e seus papeis na resposta imune. É necessário identificarmos e caracterizarmos populações celulares minoritárias que muitas vezes só podem ser analisadas através da utilização simultânea de três ou mais anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos distintos. Assim, optamos, como projeto institucional por adquiri um novo citômetro que permita uma análise simultânea multiparamétrica é imprescindível. Análises desta natureza, podem ser fundamentais para responder questões básicas relacionadas ao papel de populações celulares no desenvolvimento da resposta imune, além de permitir a continuação de projetos em outras áreas inclusive ampliando nossa área de atuação.

Apoio CNPq, FAPEMIG, EEC, NIH grant AI26505 e FIOCRUZ

O Impacto de Citometro de Fluxo no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ

Pedro Muanis Persechini



Chefe do Laboratório de Imunobiofísica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ, Rio de Janeiro, RJ

INTRODUÇÃO
Convidado para falar sobre "O Impacto do Citômetro de Fluxo" em minha instituição, sofri inicialmente um grande choque. Pela primeira vez na vida fora convidado para participar da parte mais histórica de um congresso e não de sua parte mais científica de dados originais. Inicialmente pensei que não seria apropriado, que nosso citômetro não havia impactado coisa alguma, que fora apenas mais um sofisticado equipamento adquirido por uma instituição já conhecida por ser bem equipada. Nada mais natural.
Apenas uma reflexão mais profunda me fez ver o quanto o novo equipamento mudou não só minhas linhas de pesquisa como também minha maneira de pensar sobre administração da ciência. A seguir vou contar um pouco sobre como esse processo ocorreu.
O IMPACTO !
Quando, depois de anos de espera, a FINEP finalmente liberou a verba para comprar um citômetro de fluxo ha muito tempo pedido para o Instituto de Biofísica, eu era um dos únicos pesquisadores presentes nessa instituição que atuava na área de imunologia. Os demais, por razões que iam desde estágios no exterior até a aposentadoria, estavam afastados. Portanto, eu, que apenas recentemente havia me auto-proclamado "Imunologista", deveria entender de citometria e citômetros. Deveria!...
De fato, eu já havia visto citômetro de fluxo na Rockefeller University, onde acabara de concluir meu Pós-doutorado e "sabia" que era muito útil para contar e classificar leucócitos. Sabia ainda o que era um fluorímetro e um raio LASER. Mas isso era tudo!
O primeiro impacto veio quando me pus a levantar modelos, partes opcionais e preços. Descobri que haviam dois grandes fabricantes de citômetros representados no Brasil e que o dinheiro disponível era suficiente apenas para adquirir a máquina mais simples e esta, isso vim saber muito depois, já estava ultrapassada e prestes a ser substituída. Descobri em seguida que haviam equipamentos mais sofisticados que poderiam atender não somente as rotinas básicas de contagem e classificação de leucócitos mas também poderiam medir vários outros parâmetros, como concentração intracelular de cálcio, e fazer a separação de células por qualquer critério para o qual pudéssemos estabelecer um "gate".
Essas maravilhas tecnológicas podiam comportar várias fontes de raios LASER, analisar por "gated amplifiers" e até mesmo clonar linfócitos. Concluí então que uma instituição com múltiplos usuários e problemas experimentais os mais variados necessitaria de um equipamento assim. Caso contrário, teríamos apenas um contador de células sofisticado que atenderia apenas a um pequeno grupo de usuários. O problema: essas máquinas custavam muito dinheiro! A solução: conseguimos, através de longa negociação, que um modelo moderno e quase completo fosse adquirido dentro do orçamento disponível. Foi assim que instalamos o EPICS-ELITE da COULTER, com 3 fontes de iluminação (azul, vermelho e UV) e quatro fotomultiplicadoras.
OS PROBLEMAS
Hoje, o citômetro está instalado no Setor de Citometria de Fluxo do Laboratório de Imunobiofísica onde procuramos atender a todos os usuários pertencentes ou não ao Instituto de Biofísica. Mantê-lo funcionando tem sido nosso grande desafio. A eterna crise de financiamento do sistema de pós-graduação e pesquisa brasileiro não é o único problema. A maior dificuldade são as amarras burocráticas que afetam todos os capilares desse sistema, incluindo nossa própria mente, habituada a achar normal ou inevitável que certas coisas aconteçam. Relato algumas:

  • Alocar dezenas de milhares de Dólares a um equipamento e não prever a verba para sua manutenção.

  • Contratar técnicos por concurso, oferecer oportunidades de aperfeiçoamento e não permitir sua ascensão profissional, estrangulando sua fonte de renda e frustando sua existência.

  • Impor barreiras à importação e toda sorte de dificuldades para a aquisição de peças e suprimentos.

  • Engessamento do quadro de pessoal: quem está dentro não sai; quem está fora não entra.

  • Engessamento das verbas: rubricas fechadas e regras obsoletas de administração e controle.

Um exemplo comum entre nós e que não podemos chamar de imprevisível: recentemente o LASER de 488 nm queimou. Só então pudemos justificar um pedido emergencial de verbas, solicitar autorização para importação etc. etc. Conseqüência: 6 meses de interrupção no uso de equipamento.


Como superar essa situação? Não cabe aqui uma discussão longa. O que tenho proposto, e que não atinge somente os citômetros de fluxo, pode ser resumido em poucas linhas:

  • Simplificação e desburocratização de todo o sistema de financiamento da pesquisa. A linha de financiamento criada recentemente para o Programa de Núcleos de Exelência (PRONEX), ainda precisa ser otimizada mas é um exemplo de que isso é possível.

  • Mudança de mentalidade entre os usuários, instituições de pesquisa e órgãos de fomento, com relação aos equipamentos de grande porte e de uso comum. Precisamos aprender a compartilhar equipamentos, laboratórios e custos, promovendo mudanças na organização das instituições, visando a utilização plena, a manutenção preventiva e a atualização tecnológica constante desses equipamentos.


O IMPACTO CIENTÍFICO
Finalmente gostaria de mencionar a evolução técnica e científica que o novo citômetro provocou em minhas linhas de pesquisa. Nos últimos anos aprendemos muito. Juntamente com diversos colaboradores e com usuários de diversas instituições, nosso Setor de Citometria de Fluxo está hoje habilitado a fazer uma série de análises de forma rigorosa e confiável em até 4 cores e excitação simultânea com duas fontes. Dentre elas citamos:

  • Fenotipagem de células

  • Ciclo celular e apoptose

  • Análise simultânea de superfície e macadores intracelulares tais como:

  • Proteínas contidas em vesículas de secreção

  • DNA (ciclo celular, apoptose, viabilidade)

Nada disso fazia parte de meu universo científico até o equipamento ser instalado. Hoje são rotinas que procuramos tornar disponívis para todos, tanto pela formação de pessoal na pós-graduação do Instituto de Biofísica quanto pela acessoria aos mais diversos tipos de demanda.


O FUTURO
Sob o ponto de vista administrativo, pretendemos implantar uma forma moderna de gerenciamento de operação e compartilhamento de custos que nos permitam tanto ser um centro atuante em pesquisa básica quanto uma unidade de prestação de serviços especializado de alto nível
Sob o ponto de vista experimental, pretendemos nuclear um grupo que se dedique a desenvolver soluções experimentais envolvendo citometria de fluxo, iniciando pela plena utilização da separação de células ("cell sorting"), técnica essa pouco disponível e ainda pouco dominada no Brasil


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