Cleiton fantin



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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS

ESCOLA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS DA AMAZÔNIA

CLEITON FANTIN

DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MOLECULARES DE MICROSSATÉLITES PARA O ESTUDO DO SISTEMA REPRODUTIVO EM TRÊS ESPÉCIES DE TARTARUGAS DO GÊNERO PODOCNEMIS


MANAUS

2014

CLEITON FANTIN

DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MOLECULARES DE MICROSSATÉLITES PARA O ESTUDO DO SISTEMA REPRODUTIVO EM TRÊS ESPÉCIES DE TARTARUGAS DO GÊNERO PODOCNEMIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos naturais da Amazônia da Universidade do Estado do Amazonas (UEA), como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Biotecnologia e Recursos Naturais.


Orientador: Prof Dr Luiz Alberto dos Santos Monjeló

Co-Orientadora: Profª Drª Izeni Pires Farias


MANAUS

2014

CLEITON FANTIN
DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MOLECULARES DE MICROSSATÉLITES PARA O ESTUDO DO SISTEMA REPRODUTIVO EM TRÊS ESPÉCIES DE TARTARUGAS DO GÊNERO PODOCNEMIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos naturais da Amazônia da Universidade do Estado do Amazonas (UEA), como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Biotecnologia e Recursos Naturais.


Data da aprovação ___/____/____


Banca Examinadora:
_______________

Tomas Hrbek

Universidad de Puerto Rico

___________________

Richard Carl Vogt

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

_________________________

Albertina Pimentel Lima

Universidade Federal do Amazonas

MANAUS

2014

Ficha Catalográfica






F216d

Fantin, Cleiton


Desenvolvimento de marcadores moleculares de microssatélites para o estudo do sistema reprodutivo em três espécies de tartarugas do gênero Podocnemis / Cleiton Fantin. - Manaus: UFAM, 2012.

98 f.; il. color.

Tese (Doutorado em Biotecnologia) –– Universidade Federal do Amazonas, 2012.

Orientador: Prof. Dr Luiz Alberto dos Santos Monjeló

Co-Orientadora: Profª Drª Izeni Pires Farias

1. Tartarugas – Reprodução - Estudo 2. Quelônios – Amazônia 3. Quelônios – Genética de populações 4. Ácido desoxirribonucléico microssatélite I. Monjeló, Luiz Alberto dos Santos II. Farias, Izeni Pires III. Universidade Federal do Amazonas IV. Título


CDU 598.13(043.2)

(Catalogação na fonte realizada pela Biblioteca Central – UEA)

Dedicatória.

Epígrafe”.


Autor

AGRADECIMENTOS
À CAPES pelo auxílio financeiro.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia da UEA.

Ao .......


RESUMO
Poucos dados estão disponíveis com relação à biologia da reprodução no gênero Podocnemis, mais especificamente com relação ao sistema de reprodução. Até hoje os estudos sobre sistema de reprodução realizados no gênero Podocnemis foram realizados somente com P. expansa.................

ABSTRACT
Few data are available about reproductive biology of the genus Podocnemis, especially with respect to the type of mating system. To date studies of mating system with species of the genus Podocnemis have been done only with P. expansa. ……….

1LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1 - Characterization of 18 microsatellites loci of Podocnemis unifilis.........................20

Tabela 2 - Cross-species amplification test...............................................................................21


CAPÍTULO II

Tabela 1 - Microsatellites loci screened for the paternity test in P. unifilis (from Fantin et al. 2007).........................................................................................................................................47

Tabela 2 – Number of alleles (N), Number of homozygotes (Nh), and Infered number of extra aleles (Inea) in each locus per nest of P. unifilis. .....................................................................48


2LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1 – Exemplar de P. unifilis..............................................................................................4

Figura 2 – Exemplar jovem de P.sextuberculata (A). Plastrão exibindo os tubérculos (B).......5

Figura 3 – Filhote de P. erythrocephala.....................................................................................7
CAPÍTULO II

Figure 1 - Map showing the location of Barreirinha site for the nests of P. unifilis studied in the present work. ).....................................................................................................................49

Figure 2. Distribution of relatedness (rxy) values for pairs of offspring from each clutch of P. unifilis. )....................................................................................................................................50
CAPÍTULO III

Figura 1 - Mapa mostrando o local de coleta dos ninhos de P. sextuberculata........................56

Figura 2 - Gráficos da relação de parentesco entre os filhotes, para cada ninho analisado......61


SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1

2 REFERENCIAL TEÓRICO 1

2.1 Considerações gerais 1

2.2 Família Podocnemididae 2

2.3 Podocnemis unifilis 4

2.4 Podocnemis sextuberculata 5

2.5 Podocnemis erythrocephala 6

2.5.1 Marcadores moleculares 15

3 OBJETIVO GERAL 15

3.1 Objetivos específicos 17

CAPÍTULO I 22

CAPÍTULO II 27

4 DISCUSSÃO GERAL 51

5 CONCLUSÃO 70

6 REFERÊNCIAS 88

* Cada capítulo deverá ser escrito em forma de artigo científico

* Se você possuir apenas 1 Capítulo, os itens 4 e 5 já estarão inclusos no mesmo

1 INTRODUÇÃO
Na introdução o aluno deverá explicar o assunto que deseja desenvolver.
Os quelônios são os mais antigos répteis existentes. Surgiram na Era dos répteis, há cerca de 230 milhões de anos, sendo de linhagem mais antiga que os dinossauros fósseis (FERRI, 2002). Os quelônios são encontrados em locais diversos como lagos, rios, mares e pântanos, desertos e florestas. A dimensão é variável de acordo com as espécies, encontrando-se formas de dois a três metros de comprimento e também pequenas formas que atingem somente sete a doze centímetros.

São os únicos répteis que possuem casco, o qual é utilizado como um instrumento de defesa. Muitas espécies podem recolher a cabeça, as pernas e a cauda para dentro do casco, servindo como escudo de proteção. Entretanto, muitas espécies não conseguem executar esse movimento, como por exemplo, a tartaruga marinha.

Os quelônios têm vida mais longa que qualquer outro vertebrado, podendo as espécies terrestres viver mais de cem anos e geralmente estão associados à baixa substituição de indivíduos na população. No entanto, a maior parte do desenvolvimento biológico destes animais só ocorre durante os 5 a 10 anos de existência e, segundo pesquisas, a maturidade sexual só acontece aproximadamente aos sete anos para os machos e 11 a 15 anos para as fêmeas (IBAMA, 1989).

Muitas espécies de quelônios estão em vias de extinção, conseqüência da perseguição desmedida do homem, que destrói os ovos e pratica a caça predatória na época de reprodução, além de promover a destruição do habitat natural desses animais.

Em uma estratégia para conservação, o IBAMA fornece aos criadores cadastrados no órgão, cerca de 4000 filhotes e os criadores comprometem-se a criá-los até a idade adulta e reproduzi-los em cativeiro, com a permissão de comercializar 60%. Entretanto ainda falta um suporte técnico adequado aos órgãos governamentais e aos criadores, para indicar de onde devem ser fornecidos os filhotes para cada local, a fim de manter em cativeiro os mesmos níveis de variabilidade genética das populações naturais, bem como para um manejo adequado das espécies em cativeiro.

Embora ilegal, a venda de quelônios capturados na natureza ainda é extremamente elevada no Estado do Amazonas. Isto não é só devido ao hábito local de consumir estes animais, mas também devido à ineficiência da fiscalização pelos órgãos competentes (ALHO, PÁDUA, 1982).



2 REFERENCIAL TEÓRICO
Deverá descrever o que já foi escrito sobre o tema abordado
2.1 Considerações gerais
O manejo de diversas espécies ameaçadas é baseado em conhecimento incompleto da dinâmica populacional. Faltam informações demográficas específicas, principalmente em relação ao manejo de organismos de vida longa (PEZZUTI, VOGT, 1999).
2.2 Família Podocnemididae
Esse grupo de tartarugas se caracteriza por retrair o pescoço em forma lateral debaixo da carapaça, ausência de um escudo nucal e possuir o dorso da cabeça coberto com escamas grandes justapostas. Na maior parte das espécies da família, a cabeça dos machos é mais escura que a das fêmeas e quase sempre os adultos conservam as manchas que apresentam quando juvenis (RUEDA-ALMONACID et al., 2007).
2.3 Podocnemis unifilis (TROSCHEL, 1848)
Podocnemis unifilis (Figura 1), conhecida popularmente como tracajá (fêmea) e Zé prego (macho), possui a carapaça cinza escura quando molhada. Apresenta as patas curtas e cobertas com pele rugosa, cabeça achatada e cônica, de pequeno tamanho em relação ao corpo. Os olhos, bastante juntos, são separados por um sulco. A fêmea adulta pesa em torno de oito quilos e mede cerca de 38 cm (PRITCHARD, TREBBAU, 1984). É uma tartaruga essencialmente aquática. Pritchard e Trebbau, (1984) e Iverson (1992) citam que esta espécie pode ser encontrada nas bacias dos rios Amazonas e Orinoco e seus afluentes, no norte da América do Sul, ocorre em rios de água preta, clara e branca bem como em lagos e reservatórios.

Estudos realizados por (HALLER, RODRIGUES, 2005), em ninhos de P. unifilis da Reserva Biológica do rio Trombetas-PA, Brasil, demonstram que as covas são de aproximadamente 17 cm de profundidade, apresentando uma média de 19 ovos por ninho, variando de 7 a 27, e o período de incubação vai de 58 a 66 dias.


Figura 1 – Exemplar de P. unifilis.

Fonte: Richard Vogt

2.4

2.5


2.6 etc.

3 OBJETIVO GERAL

Investigar o comportamento reprodutivo de Podocnemis expansa, estudando indivíduos recém-eclodidos provenientes de cativeiro e natureza.



3.1 Objetivos específicos
- Genotipar os filhotes de P. expansa de todos os ninhos;
- Determinar os níveis de parentesco dos indivíduos dos ninhos estudados;
- Comparar se ocorre diferença em relação ao comportamento reprodutivo que será observado entre os ninhos provenientes de criadouros e natureza.







CAPÍTULO I

Análise de paternidade através de marcadores microssatélites, em ninhos de Podocnemis erythrocephala (Testudines, Podocnemididae) de duas localidades da Amazônia brasileira.


Cada capítulo deverá ser escrito em forma de artigo científico, seguindo as Normas de Formatação da ABNT


Análise de paternidade através de marcadores microssatélites, em ninhos de Podocnemis erythrocephala (Testudines, Podocnemididae) de duas localidades da Amazônia brasileira.

Fantin, C.; Farias, I.P.; Monjeló, L.A.S.; & T. Hrbek
Instituto de Ciências Biológicas, Univ. Federal do Amazonas, Brasil, Manaus.


Resumo
Pouco se conhece a respeito do sistema reprodutivo entre as espécies do gênero Podocnemis, principalmente em relação às irapucas (Podocnemis erythrocephala). Usando a análise de paternidade, através de dados obtidos a partir de 4 locos de marcadores de microssatélites em 6 ninhos de duas localidades da Amazônia brasileira, identificamos a existência de paternidade múltipla nesta espécie. A quantidade de filhotes analisados representou o número total de filhotes nascidos em cada ninho. Os genótipos dos filhotes de cada ninho foram identificados, e apesar de não possuirmos amostras das fêmeas, os alelos maternos foram inferidos analisando-se os filhotes homozigotos de cada ninho, para cada loco. Para a análise do tipo de paternidade utilizamos o método de contagem de alelos presentes em cada loco/ninho. Esta espécie mostrou-se promíscua, evidenciando paternidade múltipla em 83.3% dos ninhos analisados. Apesar de o número amostral ser baixo, encontramos paternidade única em apenas um ninho de uma das localidades estudadas, portanto, é possível que exista diferença no padrão do tipo de paternidade entre populações desta espécie.

1 INTRODUÇÃO
Podocnemis erythrocephala é facilmente distinguida de suas congêneres devido ao seu pequeno porte, cujo tamanho é inferior a 32 cm. Geralmente as fêmeas são maiores que os machos, medindo em torno de 27 cm. A coloração vai de marrom-escuro a preto, a carapaça é expandida na porção posterior; apresenta um par de barbelos embaixo do queixo, e uma faixa vermelha brilhante que se estende da parte de trás da cabeça até os tímpanos (MITTERMEIER, WILSON, 1974b; PRITCHARD, TREBBAU, 1984).

Fantin et al. (2007), construíram uma biblioteca genômica para Podocnemis unifilis otimizando as condições para 18 locos de microssatélites para esta espécie. Por serem altamente polimórficos e principalmente co-dominantes, estes marcadores tornaram-se especiais para estudos em nível populacional, individual, bem como para a análise de parentesco entre algumas espécies de quelônios. Dentre os 18 locos desenvolvidos para P. unifilis, vários locos mostraram-se polimórficos no teste de transferibilidade em outras 5 espécies da família Podocnemididae, sendo 4 espécies do gênero Podocnemis (P. expansa, P. sextuberculata, P. erythrocephala e P. volgi) além de Peltocephalus dumerilianus.


2 MATERIAL E MÉTODOS

Utilizamos 6 ninhos de P. erythrocephala de 2 locais da Amazônia brasileira, para o estudo da paternidade. Destes ninhos, 4 foram coletados no município de Santa Isabel do rio Negro-AM (S4º31´55,6´´/W64º55´11,5´´) (Ninho 1, 2, 3 e 4), e 2 em Parintins-AM (S2º46´30´´/W56º46´17´´) (Ninho 5 e 6) (Fig. 1).

Figura 1. Mapa mostrando os 2 locais de coleta dos ninhos de P. erythrocephala.



Tabela 1. Características dos 4 microssatélites utilizados na genotipagem de P. erythrocephala, Ho= Heterozigozidade observada, He= Heterozigozidade esperada, Q= Probabilidade de exclusão de paternidade, I= Probabilidade de identidade.




Loco

Repetição

TºC

Nº de indivíduos/ alelos

Ho

He

Q

I

Referências

Puni_1D9

(GA)12

62

36/3

0,38889

0,63459

0,3391

0,2451

Fantin et al. 2007

Puni_1E1

(CT)9tt(CT)7

64

35/7

0,57143

0,79876

0,5966

0,0793

Fantin et al. 2007

PE344

(AG)13

55

37/6

0,72973

0,75639

0,5268

0,1136

Valenzuela, 2000

PE519

(CT)7(CA)8(CG)2(CA)8

55

33/10

0,69697

0,78275

0,6099

0,0724

Valenzuela, 2000

Total










0,59675

0,74312

QC=0,9507

IC=1,59x10-4






3 RESULTADOS
Dos 6 ninhos de P. erythrocephala analisados, apenas 1 não apresentou paternidade múltipla (Ninho 6). Nossas análises, através da contagem de alelos e da inferência dos genótipos maternos, evidenciaram um mínimo de dois machos contribuindo nos ninhos onde existe paternidade múltipla.
4 DISCUSSÃO
Apesar da quantidade de locos de microssatélites utilizada ser pequena, a combinação dos locos evidenciou um bom poder de detecção do tipo de paternidade para P. erythrocephala. As análises realizadas com os 4 locos encontraram uma probabilidade de identidade (I) de 1,59x10-4 e probabilidade de exclusão de paternidade (Q) de 95.07% (Tabela 1). Pearse et al. (2006) em estudos de paternidade em P. expansa, indicaram que a probabilidade de exclusão de paternidade de 95% tem suficiente poder para detectar machos adicionais contribuindo na prole de um ninho.

De acordo com Fantin (2008) como toda progênie herda um alelo materno e um paterno, cada membro da ninhada deve conseqüentemente herdar um dos dois alelos maternos e um de um pool de alelos paternal, dependendo do número de pais contribuindo na prole.

As densidades populacionais podem também alterar as taxas de contato intersexual e consequentemente o padrão reprodutivo (WESTNEAT, SHERMAN, 1997). Quando a densidade e a persistência dos machos aumentam, a resistência da fêmea pode tornar-se mais difícil (KREBS, DAVIES, 1996).

Investigar os efeitos benéficos da paternidade múltipla, incluindo benefícios para a prole pode ser muito difícil de demonstrar, mas tem sido constatado em diversos grupos (EVANS, MAGURRAN, 2000; KRAAIJEVELD-SMIT et al., 2002; OLSSON et al., 1996).


5 REFERÊNCIAS


ALTAMIRO, J.S. et al. A metodologia do ensino na graduação. 2. ed. Rio de Janeiro: Vozes, 1988.


DELLAMANO, José Claudio. Otimização da etapa de armazenamento de Rejeitos Radioativos. 2005. 127 f. Tese (Doutorado em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear-Aplicações)-Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo, 2005.
NASSIF, L. A Modernização da construção civil. Folha de São Paulo, 3 out. 1997. Cad. 2, p. 3.
OLIVEIRA, P.S. de. Introdução à sociologia. 18. ed. São Paulo: Ática, 1998.
RODRIGUES, M. A estrutura do conhecimento. Enfoque, São Paulo, v. 11, n. 1, p. 51-59, jan. 1983.
SÁTIRO, A.; WUENSCH, A.M. Pensando melhor: iniciação ao filosofar. São Paulo: Saraiva, 1997.

CAPÍTULO II
Apenas se o aluno tiver resulatdos para escrever mais de um artigo científico
Análise de paternidade através de marcadores microssatélites, em ninhos de Podocnemis erythrocephala (Testudines, Podocnemididae) de duas localidades da Amazônia brasileira.




4 DISCUSSÃO GERAL
Discussão, análise e interpretação dos resultados obtidos de uma forma geral nos diferentes Capítulos

5 CONCLUSÃO

As conclusões devem ser apresentadas de forma lógica, clara e concisa, fundamentando os resultados obtidos na discussão

6 REFERÊNCIAS

ALTAMIRO, J.S. et al. A metodologia do ensino na graduação. 2. ed. Rio de Janeiro: Vozes, 1988.


DELLAMANO, José Claudio. Otimização da etapa de armazenamento de Rejeitos Radioativos. 2005. 127 f. Tese (Doutorado em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear-Aplicações)-Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo, 2005.
NASSIF, L. A Modernização da construção civil. Folha de São Paulo, 3 out. 1997. Cad. 2, p. 3.
OLIVEIRA, P.S. de. Introdução à sociologia. 18. ed. São Paulo: Ática, 1998.
RODRIGUES, M. A estrutura do conhecimento. Enfoque, São Paulo, v. 11, n. 1, p. 51-59, jan. 1983.
SÁTIRO, A.; WUENSCH, A.M. Pensando melhor: iniciação ao filosofar. São Paulo: Saraiva, 1997.







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