Choricystis minor var. Minor



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25 e 26 de setembro de 2014





AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS E DE PIGMENTOS DA MICROALGA CHORICYSTIS MINOR VAR. MINOR EM FUNÇÃO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO

A. T. SOARES1, R. S. MENEZES1, R. G. LOPES2, R. B. DERNER2 e N. R. ANTONIOSI1*


1 Universidade Federal de Goiás, Instituto de Química

2 Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Aquicultura

*Autor correspondente E-mail para contato: nlliantoniosi@gmail.com


PALAVRAS-CHAVE: microalga, choricystis, meio de cultivo, ácidos graxos, biodiesel, pigmentos.


INTRODUÇÃO

A partir da biomassa das microalgas são obtidos diversos bioprodutos de alto valor agregado, tais como: corantes, antioxidantes, ácidos graxos, enzimas, polímeros, fármacos e, mais recentemente, utilizada como fonte de matéria prima graxa para a produção de biodiesel 1. Inúmeras pesquisas têm sido realizadas considerando a produção de biodiesel a partir de microalgas, com o intuito de reduzir o preço do biodiesel comercializado, para torná-lo mais viável e capaz de suportar a demanda de combustível 2. Contudo, para que as microalgas sejam utilizadas como matéria-prima para a produção desse biocombustível é fundamental selecionar cepas capazes de produzir biomassa com elevado teor de lipídios e com perfil adequado de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), bem como determinar as condições ambientais ideais para o cultivo visando produzir um biodiesel que alcance os padrões de qualidade exigidos por normas nacionais e internacionais 3. Estudos já demostraram que o rendimento em lipídios na biomassa é influenciado pelas condições de cultivo e/ou estresse, que também têm efeito na quantidade e nos tipos de ácidos graxos sintetizados 4,5. Apesar de ser destacada como promissora fonte de matéria prima graxa por Menezes et al. 1 a microalga Choricystis minor var. minor ainda é uma espécie pouco estudada, sendo necessário à realização de uma série de pesquisas visando à identificação dos meios e dos métodos de cultivo ideais para o seu crescimento, bem como para determinar as condições ideais para a biossíntese dos lipídios, produção de pigmentos e outros biocompostos de interesse comercial.


OBJETIVOS

Avaliar a influência do meio de cultivo no crescimento, no perfil e teor de ácidos graxos e na composição de pigmentos da microalga Choricystis minor var. minor, visando, principalmente, sua utilização bioenergética como fonte de matéria prima graxa para a produção de biodiesel.


MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento consistiu no desenvolvimento de culturas experimentais de C. minor var. minor empregando dois meios de cultivo como tratamentos: (i) meio de cultivo WC que possui, principalmente, em sua composição os seguintes nutrientes/quantidades: 1,00 mM NaNO3; 0,25 mM CaCl2.2H2O; 0,15 mM MgSO4.7H2O; 0,15 mM NaHCO3; 0,05 mM K2HPO4; 0,01 mM FeCl3.6H2O; 0,01 mM H3BO3 e; (ii) meio de cultivo BBM que possui, principalmente, em sua composição os seguintes nutrientes/quantidades: 2,94 mM NaNO3; 0,17 mM CaCl2.2H2O; 0,30 mM MgSO4.7H2O; 0,43 mM K2HPO4; 1,29 mM KH2PO4; 0,01 mM FeSO4.7H2O; 0,18 mM H3BO3. Os dois tratamentos foram realizados com quatro repetições. As culturas foram desenvolvidas em frascos cilíndricos de vidro borossilicato contendo 1,8 L dos respectivos meios de cultura, a 23 ± 1 °C, com agitação constante por borbulhamento com ar atmosférico enriquecido com 0,5% de CO2 e iluminação de 150 µmol fótons m-2 s-1 com fotoperíodo integral (24:0). A biomassa empregada como inóculo foi centrifugada, e lavada uma vez com água estéril para retirada de resíduos do meio de cultura, e as unidades experimentais foram inoculadas com o correspondente a 0,10 g L-1 em biomassa seca. O crescimento das culturas (biomassa) foi estimado diariamente através da medida da turbidez, até as culturas alcançarem a fase estacionária. Essa determinação foi realizada empregando a equação C= 0,0007 x OD680 – 0,0063, com R2=0,98703, onde: OD é a densidade óptica a 680 nm e C é a concentração em biomassa seca em g L-1. As curvas de crescimento foram elaboradas empregando a média das quatro repetições de cada tratamento. Para a determinação do teor de ésteres de ácidos graxos, a biomassa foi coletada no segundo dia da fase estacionária em ambos os tratamentos. As amostras foram centrifugadas (3500 rpm/10 min.) e a biomassa foi lavada uma vez com água destilada para a retirada dos sais do meio de cultura, com posterior congelamento e liofilização individual das réplicas biológicas. Os dados correspondem à média das quatro repetições de cada tratamento.

Transesterificação direta e análise de FAME

O procedimento de transesterificação direta da biomassa de C. minor var. minor em FAME foi realizado através do método de Hartman e Lago adaptado para microescala, como descrito por Menezes et al.1. A fase orgânica (heptânica), que contém os FAME, foi coletada e analisada por cromatografia gasosa como descrito por Menezes et al.1. Para o cálculo do teor de ácidos graxos foi realizada uma curva de calibração com óleo de soja em heptano, com seis concentrações (20, 30, 45, 60 e 70 mg.mL-1). A curva foi preparada plotando a concentração da soja versus a área total de FAME. A regressão linear foi feita no Microsoft Excel Windows 7 com coeficiente de correlação (r2) maior que 0,99.



Extração e Análise dos Pigmentos

O método foi baseado em Inbaraj et al.6. Inicialmente, para cada tratamento, pesou-se 500,0 mg da biomassa de C. minor var. minor em erlenmeyer e foram adicionados 10,0 mL de solução de solvente extrator. A mistura foi colocada em banho de ultrassom por 40 min. Em seguida, foi adicionada solução de Na2SO4 10% para a separação de fases. A fase superior contendo, os carotenoides, foi coletada e separada. Este procedimento de extração foi realizado repetidamente, até não haver traços de pigmentos no resíduo de biomassa. A fase superior dos extratos de pigmentos foi evaporada, dissolvida em 2,5 mL de solução metanol/diclorometano (1:1) e filtrada em membrana 0,2 µm para análise por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), com detector de arranjos de diodos (DAD), como descrito por Inbaraj et al. 6. As extrações e as análises em HPLC-DAD foram feitas em duplicatas. A identificação dos carotenóides foi feita por comparação com os tempos de retenção e por espectros de absorção dos picos não identificados. Os isômeros cis dos carotenóides foram identificados com base em dados reportados na literatura. Os pigmentos foram quantificados por HPLC, por meio da curva de calibração do padrão luteína, clorofila a, e β caroteno com seis concentrações (1, 5, 10, 15, 30 e 60 µg.mL-1). A curva foi preparada plotando a concentração do padrão interno versus a sua área. A regressão linear foi feita no Microsoft Excel Windows 7 com coeficiente de correlação (r2) maior que 0,99.




RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os tratamentos com os meios WC e BBM apresentaram biomassa máxima alcançada média de 0,52±0,02 g L-1 e 1,00±0,02 g L-1, respectivamente. Esses valores foram alcançados com 05 (cinco) dias de cultivo após a inoculação com o meio WC e 08 (oito) dias de cultivo em meio BBM. Com o intuito de favorecer uma maior concentração de lipídeos na biomassa de C. minor em ambos os tratamentos, as culturas foram mantidas durante dois dias em fase estacionária, após alcançarem a biomassa máxima, aumentando assim o estresse nutricional. Embora o meio BBM apresentasse em sua composição aproximadamente 03 vezes mais nitrogênio (2,94 mM) do que o meio WC (1,00 mM) e 34 vezes mais fósforo (1,72 mM, contra 0,05 mM), os valores de biomassa máxima encontrada não foram tão extremos.

Análise do teor de FAME por GC-FID

A transesterificação direta da biomassa é uma metodologia rápida para a identificação e quantificação do conteúdo de ácidos graxos na biomassa de microalgas. Pela TD da biomassa de C. minor var. minor, o tratamento com meio WC apresentou percentual de ácidos graxos variando de 13,81 a 21,64%, enquanto no tratamento com meio BBM esse intervalo variou de 8,45 a 10,18%. O tratamento com meio WC foi o que proporcionou o maior teor de óleo (rendimento em ésteres), correspondendo, em média a 17,02%, o que é 45,77% maior do que o proporcionado pelo tratamento com o meio BBM (9,23%). Nota-se que o percentual médio de ácidos graxos obtidos com a utilização do meio WC é similar ao da soja (18%), a qual é a oleaginosa mais utilizada para produção de biodiesel no Brasil 1,2,3. Os ácidos graxos comumente encontrados nos tratamentos foram: palmítico (C16:0), oleico (C18:1 cis9), linoleico (C18:2 cis9, cis12) e linolênico (C18:3 cis9, cis12, cis15). Entre estes se destaca a presença em grande quantidade do ácido graxo oleico que, nos meios de cultivos estudados, apresentou participação média percentual de 39,23% da composição total de FAME com o emprego do meio de cultivo WC, enquanto no tratamento com o meio de cultivo BBM esse mesmo percentual atingiu 44,86%. O perfil de ácidos graxos nestas espécies de microalgas é composto majoritariamente por ácidos graxos saturados (30,39 a 28,76%) e monoinsaturados (47,37 e 43,61%). As amostras apresentaram baixo teor de ácidos graxos triinsaturados - TUFA (10,35 e 11,75%) e de ácidos graxos poliinsaturados - PUFA (2,5 e 2,3%) para os tratamentos com meio WC e BBM, respectivamente. Apesar de não haver restrições na regulamentação brasileira, a norma européia EN 14214 estipula o limite máximo aceitável de 12% para o ácido linolênico (Ln) e de 1% para os ácidos graxos com mais de três duplas ligações. Nesse contexto, destaca-se que entre os meios de cultivo estudados apresentaram teores próximos ao estabelecido pela norma européia.



Análise dos pigmentos por HPLC-DAD

O método de separação cromatográfica por HPLC-DAD, aplicado, neste trabalho, para a microalga C. minor var. minor permitiu a separação de 36 (trinta e seis) pigmentos num total de 53 minutos. Não houve diferença significativa no perfil qualitativo de pigmentos para a microalga C. minor var. minor, nos meios de cultivos estudados. Entretanto, o maior rendimento em pigmentos totais foi observado com a utilização do meio de cultivo BBM, com a produção de 346 m.g-1, enquanto o meio de cultivo WC produziu 167,5 mg.g-1. Isso representa um decréscimo de 51,6 % no teor de pigmentos totais. Em ambos meios de cultivo, a produção de clorofila e carotenoides equivale aproximadamente a 88% e 11%, respectivamente, em relação ao teor de pigmentos totais. O rendimento em clorofila e carotenoides totais foi de 146,9 e 20,6 m.g-1 para o meio WC, respectivamente, enquanto que utilizando o meio BBM o teor de clorofila e carotenoides aumentou em 52,3% e 45,8%, respectivamente. Assim, a utilização de um meio de cultivo enriquecido em nutrientes, no caso o BBM, favorece a produção de pigmentos na microalga C. minor var. minor. Dentre os carotenoides, a luteína e seus cis-isômeros estão presentes em maior quantidade (14,5 mg.g-1 – BBM e 11,5 mg.g-1 – WC), seguido pelo trans betacaroteno e seus cis-isômeros (11,3 mg.g-1 – BBM e 4,9 mg.g-1 – WC). Observou também a presença de criptoxantina (0,7 %, BBM e 0,3 %, WC), zeaxantina (≈ 6 % em ambos), violaxantina (6,5 %, BBM e 3,1 %, WC) e neoxantina (≈ 0,4 % em ambos).




CONCLUSÕES

O tratamento empregando o meio de cultivo BBM produziu maior quantidade de biomassa (1,00 g L-1) em relação ao tratamento com meio de WC. Apesar de produzir maior quantidade de biomassa, a utilização do meio de cultivo WC mostrou-se mais eficiente no rendimento em ésteres para a produção de biodiesel (45,77% maior) do que o proporcionado pelo tratamento com o meio BBM. O percentual médio de ácidos graxos obtidos com a utilização do meio WC é similar ao da soja (18%), a qual é a oleaginosa mais utilizada para produção de biodiesel no Brasil. Contudo, visando à produção em pigmentos, o meio de cultivo BBM produziu, em média, o dobro de carotenoides e clorofila, sendo mais adequado para esta finalidade do que o tratamento com o meio de cultivo WC. Não houve variações significativas no perfil de ácidos graxos nos dois tratamentos empregados.


AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Ministério da Ciência Tecnologia e Inovação ao apoio financeiro concedido por meio da FINEP e do CNPq e a FUNAPE pela administração dos recursos.


REFERÊNCIAS

1 Menezes R.S., Leles M. I. G., Soares A. T., Franco P. I. B. M., Antoniosi Filho N.R., Sant'anna C.L., Vieira A. A. H. Avaliação da potencialidade de microalgas dulcícolas como fonte de matéria-prima graxa para a produção de biodiesel. Química Nova, n. 36, n. 1, p. 10-15, 2013.

2 Soares A. T., Costa D. C., Silva B. F., Lopes R. G., Derner R. B., Antoniosi Filho N. R. Comparative analysis of the fatty acid composition of microalgae obtained by different oil extraction methods and direct biomass transesterification. Bioenergy Research, 2014.

3 Soares A.T., Silva B. F., Fialho L. L., Pequeno M. A. G., Vieira A. A. H., Souza A. G., Antoniosi Filho N. R. Chromatographic characterization of triacylglycerides and fatty acid methyl esters in microalgae oils for biodiesel production. Journal Renewable Sustainable Energy, v. 5, p. 1-8, 2013.

4 Knothe G. Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters. Fuel Processes Technology, v. 86, p. 1059-1070, 2005.

5 Chen Y. H., Huang B. Y., Chiang Y. H., Tang T. C. Fuel properties of microalgae (Chlorella protothecoides) oil biodiesel and its blends with petroleum diesel. Fuel. v. 94, p. 270-273, 2012.

6 Inbaraj S., Chien J. T., Chen, B. H. Improved high performance liquid chromatographic method for determination of carotenoids in the microalga Chlorella pyrenoidosa. Journal of Chromatography A, n. 1102, p.193-199, 2006.







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