Características pós-descongelamento de sêmen de suínos submetidos a diferentes concentrações de ciclodextrinas carregadas com óleo de salmão



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Características pós-descongelamento de sêmen de suínos submetidos a diferentes concentrações de ciclodextrinas carregadas com óleo de salmão
Lucas Dall’Agnol(PIBIC/Fundação Araucária/Unioeste), Christiane Garcia Vilela(Orientador), Vivian de Souza Herrmann, Yolanda Lopes da Silva, Elaine Barbosa Muniz, e-mail: chrisg_vilela@hotmail.com
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Ciências Agrárias/Marechal Cândico Rondon, PR.
Ciências Agrárias - Zootecnia
Palavras-chave: Reprodução, espermatozóides, monogástricos
Resumo

O desenvolvimento de técnicas de criopreservação de material genético possibilita melhorias na eficiência de produção animal, além da conservação de material genético por tempo indeterminado. O uso de ciclodextrinas carregadas com colesterol aumenta a motilidade pós-congelamento do sêmen de bovinos. Outros óleos insturados também parecem ter o mesmo efeito. Em suínos poucos trabalhos tem investigado o efeito de óleos insaturados na congelabilidade do sêmen. Este trabalho teve como objetivo estudar a adição de diferentes concentrações de ciclodextrinas carregadas com óleo de salmão no sêmen suíno antes do congelamento visando melhorar a motilidade e a viabilidade espermática no pós-descongelamento. Foi observado que o uso de ciclodextrina carregada com óleo de salmão na concentração de até 1,1mg/ml no sêmen não melhorou os resultados de criopreservação e acima de 1,1mg/ml foi prejudicial ao congelamento.


Introdução
A suinocultura é uma atividade de grande importância econômica mundial. A produção brasileira de carne suína está próxima a 3,4 milhões de toneladas. No segundo trimestre de 2013 foram abatidas 8,986 milhões de cabeças de suínos, representando aumento de 0,7% em relação ao trimestre imediatamente anterior e aumento de 1,6% na comparação com o mesmo período de 2012 (IBGE, 2013).

Na criação de suínos o número de leitões nascidos por porca e a taxa de repetição de estro são dados de extrema importância, pois representam a eficiência reprodutiva dos animais fixos do plantel. Qualquer biotecnologia que possa ser utilizada para melhorar esses dados contribuirá para o sucesso da atividade. As biotécnicas aplicadas à reprodução animal vem sendo cada vez mais utilizadas com esse intuito. No entanto, algumas biotécnicas ainda não alcançaram resultados satisfatórios como o congelamento do sêmen suíno.

O desenvolvimento de técnicas adequadas para a preservação e armazenamento de sêmen possibilita o melhor aproveitamento de animais com alto valor zootécnico, evita gastos e riscos com transporte de animais e permite a conservação de material genético por tempo indeterminado (Miller, 2008). Durante o processo de criopreservação do sêmen as membranas espermáticas são submetidas a uma variedade de injúrias, o que inclui estresse térmico, mecânico, químico e osmótico, que induzem a ocorrência de danos parcialmente irreversíveis ao espermatozoide, decorrentes de modificações da membrana plasmática, pela desestabilização da bicamada lipídica (Clulow et al. 2007). A perda de lipídeos da membrana plasmática de espermatozoides pode reduzir sua flacidez tornando-a menos resistente aos processos de resfriamento e congelamento. A adição de colesterol e outros lipídeos pode ajudar a minimizar ou eliminar a transição de fase durante o processo de resfriamento (Erikson, 1998). Lipídeos podem ser facilmente incorporados ou extraídos das membranas plasmáticas das células usando ciclodextrinas (Christian et al. 1997). As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos compostos por seis (alfa-ciclodextrina), sete (beta-ciclodextrina) ou oito (gama-ciclodextrina) unidades de gilcopiranose unidas por ligações alfa – (1,4), cujas moléculas se caracterizam por ter uma superfície externa hidrofílica e uma cavidade interna lipofílica. Modificando as ciclodextrinas com grupos metil ou hidroxipropil aumenta-se a sua solubilidade em água e, consequentemente, a sua capacidade para solubilizar compostos hidrofóbicos. Segundo estudos realizados com suínos, os lipídeos que compõem a membrana plasmática dos espermatozoides são os insaturados, ácido docossaexenóico (DHA, 30%) e docosapentanóico (DPA, 25%), além do colesterol (Penny et al., 2000).

O óleo de salmão por apresentar na sua composição 13% de DHA, pode ser uma opção para aumentar o conteúdo de ácidos graxos DHA e DPA e, portanto, melhor os resultados de congelabilidade do sêmen suíno.


Material e Métodos
Foi utilizado sêmen de diferentes reprodutores, da genética Agroceres, em rotina de colheita, da Central de Inseminação de Suínos, do município de Quatro Pontes – PR. Não foi utilizado sêmen com motilidade total menor que 60% e vigor menor que 3, assim como não foi utilizado sêmen com cor e odor não característico da espécie. Após a colheita na Central de Inseminação o sêmen foi encaminhado imediatamente ao Laboratório de Reprodução Animal do Centro de Ciências Agrárias da Unioeste-MCR, onde foi centrifugado a 800g por 10 minutos. Após a centrifugação o sobrenadante foi desprezado e o “pellet” obtido, ressuspendido com diluente de resfriamento. A concentração de espermatozoides no pellet foi estimada utilizando a câmara de Neubauer Improved e, com isso foi determinado o volume de ressuspenção do diluente de congelamento (lactose 11% acrescido de 20% de gema de ovo, 3% de Ovus-es-paste e 4% de glicerol), até atingir uma concentração final de 100 x 106sptz por ml. Os tratamentos consistiram da adição de ciclodextrinas carregadas com óleo de salmão em diferentes concentrações junto ao sêmen diluído com diluente de resfriamento por 10 minutos da seguinte forma: tratamento 1: controle; tratamento 2: 0,5mg/ml de ciclodextrina carregada com óleo de salmão; tratamento 3: 0,8mg/ml de ciclodextrina carregada com óleo de salmão; tratamento 4: 1,1mg/ml de ciclodextrina carregada com óleo de salmão; tratamento 5: 1,4mg/ml de ciclodextrina carregada com óleo de salmão. Após a adição do diluente de congelamento o sêmen de cada tratamento foi posteriormente envasado em palhetas de 0,5 mL e lacradas com álcool polivinílico. As palhetas foram distribuídas em uma plataforma-suporte e estabilizadas a 5 graus célcius, em refrigerador comercial, por 1 hora. Para o congelamento a plataforma foi exposta ao vapor de nitrogênio líquido, com as palhetas posicionadas horizontalmente a 5 cm acima do nível de nitrogênio líquido, por 15 minutos. Imediatamente após, as palhetas foram imersas no nitrogênio líquido e depois descongeladas para avaliação. O descongelamento foi realizado a 37 graus célsius por 30 segundos e foi avaliado a motilidade total, motilidade progressiva e vigor e viabilidade espermática. As avaliações da motilidade total, progressiva e vigor foram realizadas por microscopia óptica em aumento de 400x, e os valores expressos em porcentagem e em uma escala de 0 a 5, respectivamente (CBRA, 1998). Para a viabiliadade espermática foi realizado a coloração supravital (eosina-nigrosina) e a leitura realizada em microscópico óptico em aumento de 1000x. Foram avaliadas 100 células, sendo que os espermatozoides com membrana lesada se coram e os íntegros não. Os dados foram avaliados por meio do software Statistical Analysis System (SAS) pela aplicação dos procedimentos GLM (Análise de Variância), e testes de médias (Tukey 5%). Inicialmente foi aplicado um teste de normalidade para verificar a normalidade dos dados e homocedasticidade. Para a característica vigor foi realizada análise não paramétrica com comparação de médias pelo teste de Kruskal Wallis.
Resultados e Discussão
Os resultados de motilidade espermática pós-congelamento nos diferentes tratamentos encontram-se na tabela 1.
Tabela 1. Motilidade e vigor espermático no pós-congelamento nos diferentes tratamentos

Tratamentos

CLC/Salmão



Motilidade Total(%)

Motilidade progressiva (%)

Vigor

Controle

53±5 A

49±5 A

3 A

0,5mg/ml

49±4 A

47±5 A

3 A

0,8mg/ml

58±8 A

55±6 A

4 A

1,1mg/ml

48±6 A

37±5 A

4 A

1,4mg/ml

15±4 B

08±3 B

2 B

*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
Observa-se que a motilidade total, progressiva e o vigor espermático não diferiram entre os tratamentos controle e os tratamentos com 0,5mg/ml, 0,8mg/ml e 1,1mg/ml de ciclodextrinas carregadas com óleo de salmão. Entretanto, houve diferença significativa (P<0,05) entre esses tratamentos e a adição de 1,4mg/ml de ciclodextrinas. Apesar do resultado com 0,8mg/ml de ciclodextrina ter sido o melhor este não foi significativo quando comparado ao controle, indicando que o uso de ciclodextrinas carregadas com óleo de salmão nas dosagens utilizadas neste experimento não provocaram efeitos desejáveis na membrana plasmática como o esperado. Ainda, foi possível constatar que na adição de 1,4mg/ml de ciclodextrinas carregadas com óleo de salmão teve efeito contrário, prejudicando os resultados de congelabilidade. Nessa maior dosagem provavelmente ocorre alterações que comprometem a membrana plasmática no que tange à criopreservação, levando aos resultados insatisfatórios no pós-descongelamento. Os resultados diferem dos trabalhos de Morrier et al.(2004) e Galantino-Homer et al.(2006), porém trabalharam com colesterol e não óleo de salmão. Morrier trabalhou com ovinos e Galantino-Homer com suínos.

Os resultados de viabilidade espermática seguiram o mesmo comportamento apresentado para a motilidade total, progressiva e vigor espermático. Não houve diferença significativa (P<0,05) para essa variável entre os tratamentos com exceção do tratamento com 1,4mg/ml de ciclodextrina carregada com óleo de salmão, cujo resultado foi inferior aos demais. O tratamento controle apresentou 40% de viabilidade espermática, o tratamento com 0,5mg/ml de ciclodextrina apresentou 44% , o tratamento com 0,8mg/ ml de ciclodextrina 51%, o tratamento com 1,1 mg/ml de ciclodextrina 47% e o tratamento com 1,4mg/ml de ciclodextrina carregada com óleo de salmão apresentou 5%. Bailey et al. (2008) tiveram resultados de viabilidade espermática melhor para ciclodextrina carregada com óleo, entretanto também trabalharam com colesterol e não óleo de salmão.



Conclusões
A inclusão de ciclodextrina carregada com óleo de salmão não melhorou os resultados de congelabilidade do sêmen suíno e acima de 1,4mg/ml mostrou-se prejudicial à motilidade total, progressiva e viabilidade espermática.
Agradecimentos
A Fundação Araucária que possibilitou a realização deste trabalho e também pela concessão da bolsa de Iniciação Científica.
Referências

Christian A.E., Haynes M. P., Phillips M.C. & Rothblat G.H., (1997). Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J Lipid Res 38, 2264-2272.


Clulow, J.R., Mansfield L. J., Morris L. H., Evans G. & Maxwell W. M., (2007) A comparison between freezing methods for the cryopreservation of stallion spermatozoa. Animal Reproduction Science 108, 298 – 308.
Erikson, M.C. (1998). Chemistry and function of phospholipids. Food lipids, chemistry, nutrition and Biochemistry. New York: Marcel Dekker.
Galantino-Homer, H.L., Zeng, W.X., Megee, S.O., Dallmeyer, M., Voelkl, D. & Dobrinski, I. (2006). Effects of 2- hydroxypropylbeta-cyclodextrin and cholesterol on porcine sperm viability and capacitation status following cold shock or incubation. Mol Reprod Dev 73, 638-650.
Miller, C.D. Otimizing the use of frozen-thawed equine semen. (2008). Theriogenology 70, 463-468.
Morrier, A., Thériault, M., Castonguay, F. & Bailey, J. (2004). Effect of cholesterol loaded methyl-b-cyclodextrin on ram sperm during cryopreservation, cold-shock and artificial insemination. Vancouver, Canada: Society for the Study of Reproduction Meeting.
Penny, P.C., Noble, R.C., Maldjian, A. & Cerolini, S. (2000). Potential role of lipids for the enhancement of boar fertility and fecundity. Pig News Information 25, 119-126.



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