Características pós-descongelamento de espermatozóides suínos submetidos a diferentes métodos de resfriamento e diferentes concentrações de glicerol



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Características pós-descongelamento de espermatozóides suínos submetidos a diferentes métodos de resfriamento e diferentes concentrações de glicerol
Lucas Dall’Agnol(PIBIC/Fundação Araucária/Unioeste), Cláudio Yuri Tsutsumi, Yolanda Lopes da Silva , Elaine Barbosa Muniz, Christiane Garcia Vilela (Orientador), e-mail: lucasdallagnol19@hotmail.com
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Ciências Agrárias/Marechal Cândido Rondon-PR
Grande área e área: Ciências Agrárias - Zootecnia
Palavras-chave: criopreservação de sêmen, monogástrico, crioprotetor
Resumo
Este trabalho teve como objetivo avaliar as características pós-descongelamento de espermatozóides de suínos submetidos a diferentes métodos de resfriamento e concentrações de glicerol (crioprotetor). O delineamento experimental foi em blocos em um esquema fatorial 2 x 5, dois sistemas de resfriamento (em recipiente plástico com álcool e em recipiente diretamente na água) e cinco níveis de glicerol (1, 2, 3, 4 e 5%) no diluente de congelamento. Foi então avaliado a motilidade total, motilidade progressiva e vigor dos espermatozoides no pós-descongelamento. Os dados posteriormente foram avaliados por meio do software Statistical Analysis System (SAS) pela aplicação dos procedimentos GLM (Análise de Variância), e testes de médias (Tukey 5%). O sêmen congelado com 4 e 5 % de glicerol e resfriado diretamente na água foram os que apresentaram melhores resultados de motilidade total, progressiva e vigor.

Introdução
A suinocultura é uma atividade de grande importância econômica mundial. O desenvolvimento de técnicas para preservação e armazenamento de material genético possibilita melhorias na produção com aproveitamento de animais de alto valor zootécnico, redução de gastos e riscos com transporte de animais e a possibilidade de conservação de material genético por tempo indeterminado. Entretanto, em se tratando da criopreservação de sêmen suíno não se conseguiu atingir resultados que o viabiliza comercialmente. O sêmen de suínos apresenta notória sensibilidade ao processo de congelamento e descongelamento devido ao tipo de fosfolipídeo predominante e à relação colesterol/fosfolipídeo (Lynch, 1992). O glicerol que é o crioprotetor mais utilizado no congelamento de espermatozoides da maioria das espécies animais em suínos não deve ser utilizada em altas concentrações. Arjones et al. (1992) recomenda no máximo 4% de glicerol para que os resultados sejam satisfatórios. O período de equilíbrio e a curva de resfriamento do sêmen antes do congelamento também parece ser um fator determinante. Tendo em vista que o sucesso da criopreservação depende de diferentes parâmetros, este trabalho teve como objetivo testar diferentes concentrações de glicerol no diluente de congelamento e dois métodos de resfriamento do sêmen.
Materiais e Métodos
O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Reprodução Animal da Unioeste, Campus de Marechal C. Rondon. O delineamento experimental foi em blocos casualizados no tempo em esquema fatorial, dois métodos de resfriamento do sêmen e cinco diferentes concentrações de glicerol (1, 2, 3, 4 e 5%) adicionado ao diluente de congelamento. Foi utilizado sêmen de suínos híbridos, diluído em BTS (Bio Pig®) e resfriado a 16°C. Após a aquisição do material na granja este foi imediatamente encaminhado em caixa de isopor ao laboratório e avaliado quanto a sua motilidade total. Sêmen com motilidade total inferior a 70% não foi utilizado no experimento. Após o sêmen chegar ao laboratório esse foi centrifugado a 300 por 7 minutos, o sobrenadante desprezado e o “pellet” obtido e resuspendido com diluente lactose 11% (72,5 mL de lactose a 11%; 20 mL de gema de ovo e 1,5 mL de Orvus-es-paste–Equex). Após a centrifugação o sobrenadante foi desprezado e o “pellet” obtido, resuspendido com diluente lacotse 11% (72,5 mL de lactose a 11%; 20 mL de gema de ovo e 1,5 mL de Orvus-es-paste–Equex®). A concentração de espermatozóides então estimada utilizando a câmara de Neubauer Improved e diluído com diluente lactose 11% para uma concentração final de 200 x 106 espermatozoides/ml. Após, novamente diluído em diluente de congelamento (72,5 mL de lactose a 11%; 20 mL de gema de ovo, 1,5 mL de Orvus-es-paste–Equex® e glicerol) com as diferentes concentrações de glicerol de acordo com os tratamentos e finalizando com uma concentração final de 100 x 106 espermatozóides/ml. Uma vez diluído com diluente de congelamento com os diferentes níveis de glicerol o sêmen foi resfriado a 5o C por 120 minutos de duas formas: nas palhetas dentro de um recipiente de plástico (tipo mamadeira) com 150 ml de álcool 95% e palhetas resfriadas dentro da água. Após o resfriamento as palhetas foram colocadas em uma plataforma-suporte exposta ao vapor de nitrogênio líquido, com as palhetas posicionadas horizontalmente a 5 cm acima do nível de nitrogênio líquido, por 15 minutos. Imediatamente as palhetas foram então imersas no nitrogênio líquido e posteriormente descongeladas a 38°C por 30 segundos em banho-maria, para avaliação da motilidade total, motilidade progressiva, vigor espermático e viabilidade espermática. As avaliações da motilidade total, progressiva e vigor foram realizadas por meio da microscopia óptica em aumento de 400x e os valores expressos em porcentagem e em uma escala de 0 a 5 (CBRA, 1998). Os dados foram avaliados por meio do software Statistical Analysis System (SAS) pela aplicação dos procedimentos GLM (Análise de Variância) e testes de médias (Tukey 5%). Inicialmente foi aplicado um teste de normalidade para verificar a normalidade dos dados e homogeneidade da variância por tratamento.

Resultados e Discussão
Os resultados de motilidade dos espermatozoides pós-congelamento dos diferentes tratamentos encontram-se na tabela 1 .

Tabela 1. Motilidade pós-descongelamento dos diferentes tratamentos



Tratamentos

Motilidade Total (%)




Motilidade Progressiva (%)




Glicerol (%)













1

34± 21

B

26± 20

B

2

29± 16

B

20± 16

B

3

34± 20

B

30± 21

B

4

57± 6

A

55± 5

A

5

54± 15

AB

51± 13

A

Sistema Resfriamento













Água


49± 19

A

43± 18

A

Recipiente plástico com álcool

34± 18

B

29± 22

B

CV

34




38




* Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.

Na comparação entre as porcentagens de glicerol utilizada nas avaliações após o descongelamento, observou-se a superioridade dos resultados de motilidade total e progressiva para os níveis de 4 a 5% de glicerol. Diferentemente desse trabalho, Bianchi et. (2008) optou por utilizar uma concentração de glicerol no sêmen de suínos para congelamento de 3%. A maioria dos trabalhos utiliza aproximadamente 2% de glicerol (Ohata et al., 2001) e Arjones et al. (1992) não recomenda mais de 4%, diferindo dos resultados desse trabalho. Apesar dessa diferença os resultados de motilidade encontrada nos tratamentos com 4 e 5% de glicerol desse trabalho estão de acordo com as observadas por Ohata et al. (2001) e superiores aos de Berger & Fischerleitner (1992).

Em relação aos dois métodos de resfriamento do sêmen antes do congelamento o tratamento em que as palhetas foram resfriadas dentro da água apresentou resultados melhores que quando as palhetas foram colocadas dentro de um recipiente de plástico contendo álcool. Apesar de não ter sido avaliado, possivelmente, a curva de resfriamento foi mais lenta na água que no álcool o que pode ter acarretado em menos danos aos espermatozoides.

O vigor espermático foi melhor (P<0,05) nos tratamentos com 4% (2,9±0,3) e 5% (2,9±0,3) de adição de glicerol em comparação com a concentração de 1% (1,5±0,4), 2% (1,9±0,3) e 3% (1,9±0,5) para o sistema de resfriamento no recipiente plástico com álcool. No resfriamento direto na água não houve diferença significativa no vigor, apesar de que os níveis 4% (3,1±0,5) e 5% (3,1±0,3) apresentaram melhores resultados quando comparado com 1% (3,1±0,5), 2% (3,0±0,4) e 3% (2,9±0,5).



Conclusões
A concentração de glicerol que apresentou melhores resultados para o congelamento de sêmen de suínos foi de 4% e 5% e o método de resfriamento melhor foi o em água a 5°C.
Agradecimentos
Agradeço a Fundação Araucária pela concessão da bolsa
Referências
Arjones, Chantril LA, Cokinakis A. Metabolism of glycerol by mature boar spermatozoa, J Reprod Fertil 1992; 94(1): 129-134.
Berger, B.; Fischerleitner, F. 1992. On deep freezing of boar sêmen: investigations on the effects of different straw volumes, methods of freezing and thawing extenders. Reproduction in Domestic Animals, v. 27, p. 266-270.
Ohata, P. M.; Wentz, I.; Bernardi, M. L., Castagna, C, Bortolozzo, F.P. Viabilidade do sêmen suíno congelado submetido a um período de equilíbrio pré-congelamento com ou sem a presença de plasma seminal. Arquivos da Faculdade de Veterinária. UFRGS. 29(2):123-129, 2001.

SAS Institute Inc., Version 9.1.3, Cary, NC: SAS Institute Inc, 2005.






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