Avaliação do crescimento de Saccharomyces boulardii cultivada em permeado de soro de leite por diferentes metodologias de quantificação e secagem



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Avaliação do crescimento de Saccharomyces boulardii cultivada em permeado de soro de leite por diferentes metodologias de quantificação e secagem
Izabela Miotto(PIBIC/CNPq/Unioeste), Salah Din Mahmud Hasan, Grettya Maria Assunção, Daniela Estelita Góes Trigueros, Mônica Lady Fiorese (Orientador), e-mail: mlfiorese@gmail.com
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Engenharias e Ciências Exatas/Toledo-PR
Grande área e área: Engenharias - Engenharia Química
Palavras-chave: correlação, bioprocesso, resíduo.
Resumo
Durante o processo de concentração do soro de leite, ocorre a geração do líquido denominado permeado de soro. Este possui elevado teor de lactose, sais minerais, vitaminas e água sendo um resíduo com potencial em aplicações biotecnológicas. Nesta pesquisa foi utilizada a levedura Saccharomyces boulardii como microrganismo, pois esta é considerada um microrganismo probiótico, sendo seu principal uso, no combate de infecções gastrointestinais. Assim, o objetivo desta pesquisa foi quantificar de forma rápida e adequada o crescimento celular de S. boulardii em meio permeado de soro + sais por diferentes metodologias: densidade óptica (DO), concentração celular [X] (g.L-1), número de células viáveis (NCV.mL-1), e contagem total de bolores e leveduras (UFC.mL-1), com posterior construção de curvas de correlação entre DO versus as demais metodologias testadas. Avaliou-se também dois diferentes equipamentos na secagem da célula obtida, visando avaliar a perda de viabilidade celular. Os resultados mostram que todas as correlações obtidas, foram capazes de descrever o crescimento microbiano de S. boulardii frente aos dados experimentais. Em relação à secagem, os resultados mostram que houve perda de viabilidade celular nos dois métodos testados. Conclui-se, portanto, que a partir da obtenção da correlação entre a metodologia rápida e de resposta online (DO), é possível obter a estimativa da concentração e número de células viáveis de S. boulardii, referente a secagem, verifica-se que é necessário adicionar um protetor celular para tentar minimizar as perdas durante o processo.
Introdução
O soro constitui em cerca de 80 a 90% do volume de leite utilizado inicialmente e tem aproximadamente 55% dos nutrientes do leite (BYLUND, 2003). As indústrias geradoras deste resíduo passaram à utiliza-lo na produção de produtos alternativos fazendo uso da tecnologia de separação por membranas, onde obtém-se ao final do processo um retentado e um permeado. O retentado é utilizado na produção de concentrado proteico de soro de leite, já o permeado, devido a sua composição rica em sais minerais e lactose, pode ser utilizado em processos biotecnológicos. Nadai (2015) cita que a aplicação do permeado em um processo fermentativo utilizando a levedura Saccharomyces boulardii possibilita obter quantidade significativa de biomassa celular, sendo que está pode ser utilizada na alimenta humana e animal, tendo como relevância o fato desta levedura ser probiótica, ou seja, quando ingerida exerce efeitos benéficos ao hospedeiro sendo uma alternativa para a prevenção ou tratamento de doenças, especialmente a diarreia derivada da infecção causada pelo Clostridium dificille, e outros tipos de diarreia (MULLER, 2006).

Assim, torna-se necessário a avaliação constante das células durante todas as etapas do processo. Para isso utilizam-se métodos de quantificação celular, o podendo ser realizado por técnicas definidas como diretas e indiretas. Estes métodos são considerados essenciais para o conhecimento e controle do crescimento do microrganismo, pois são capazes de avaliar a sua viabilidade celular, as condições de crescimento e o número de células existentes (HISS, 2001). Já para comercializar a biomassa é necessário que ela passe por um processo de secagem, e que este, não provoque redução no número de células viáveis do microrganimo durante sua aplicação.

Diante do exposto, o objetivo desta pesquisa consistiu em avaliar o crescimento microbiano da levedura S. boulardii em meio permeado de soro + sais, por diferentes metodologias (diretas e indiretas), afim de obter-se curvas de correlação entre as diferentes técnicas testadas, além de avaliar a viabilidade celular por dois diferentes métodos de secagem.
Materiais e Métodos
Substrato, microrganismos e hidrólise: O substrato utilizado neste estudo foi o permeado de soro de leite em pó fornecido pela empresa SOORO – Ingredientes Ltda. A levedura utilizada foi a Saccharomyces boulardii CCT 4308, referência UFPEDA 1176, Coleção de Culturas Tropical – Fundação André Tosello.

Cultivos de S. boulardii: Os cultivos foram realizados em meio contendo permeado de soro de leite hidrolisado na concentração de 180 gL-1 acrescido de sais: sulfato de amônio (7,5 gL-1), sulfato de magnésio1,25 gL-1), e fosfato monobásico de potássio (1,5 gL-1), pH 5,5, incubação à 30oC e tempo de cultivo 30 horas, conforme proposto em estudo realizado por Nadai (2015). Em intervalos de 2 horas em média, coletou-se amostras para posterior leitura de densidade óptica em espectrofotômetro UV-Vis (Shimadzu UV-1800) (600 nm), contagem de bolores e leveduras em placa, contagem de células em câmara de Neubauer, e análises analíticas de pH, açúcares redutores (AR), e concentração de glicose.

Quantificação celular: para a quantificação do crescimento utilizou as metodologias de leitura de densidade óptica em espectrofotômetro (600 nm), concentração celular por determinação de massa seca conforme metodologia proposta por Muller, 2006, contagem celular em Câmera de Neubauer segundo metodologia de Lee, et al., 1981 e contagem de bolores e leveduras em placas pela metodologia proposta por Silva et al., 1997.

Secagem: ao final do cultivo 1, realizou-se a quantificação de S. boulardii para avaliar a viabilidade celular antes, e após submetida ao processo de secagem em estufa de Circulação Forçada e Desidratador, ambos em temperatura de 55oC.
Resultados e Discussão
A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos para o crescimento de S. boulardii em meio permeado de soro + sais durante as 30 horas de cultivo, quantificado experimentalmente pelas metodologias de leitura de densidade óptica (DO) contagem total de bolores e leveduras (UFC.mL-1), células viáveis por câmera de Neubauer (NCV.mL-1) e concentração celular [X] (gL-1), e também os valores obtidos pelas correlações DO versus (UFC.mL-1), DO versus (NCV.mL-1) e DO versus [X](gL-1).

.


Tabela 1 – Valores experiemntais e calculados para as diferentes metodologias de quantificação celular testatas.

Tempo

DOexp.

UFCexp.

NCVexp.

[X]exp.

DOcal.

UFCcal.

NCVcal.

[X]cal.

0

0,00

900000

1000000

0,00

0,37

1655952

1618106

0,73

2

1,45

1600000

2200000

0,58

1,55

2042857

2000459

0,89

4

2,80

3200000

3375000

1,16

2,73

2810714

2759282

1,20

6

4,10

5000000

4500000

1,74

3,92

4554762

4482812

1,92

8

5,40

7800000

6000000

2,32

5,10

6570635

6474969

2,75

10

6,75

9000000

10200000

2,91

6,31

9804762

9671047

4,08

12

7,20

16000000

14100000

3,48

7,47

14388095

14200459

5,97

14

8,60

17400000

18000000

4,07

8,68

17927778

17698498

7,42

16

9,80

20000000

20250000

4,65

9,86

20828571

20565165

8,62

17

11,40

15000000

13500000

5,23

11,04

14949697

13534884

8,21

24

12,20

9000000

9500000

6,00

12,62

9252727

9162791

7,29

*Exp- Experimental

*Cal -Calculado


Os resultados obtidos mostram que todas as correlações conseguiram descrevem perfeitamente os dados experimentais.

Referente à etapa de secagem, os resultados mostram que houve perda da viabilidade celular de 29,23% para estufa de circulação forçada (inicial = 92x105 e final 70,77x105, expresso em UFC.mL-1) e de 24,61% em desidratador (inicial = 182x105 e final 75,38x105, expresso em UFC.mL-1).


Conclusões­­
Conclui-se que com a obtenção de curvas de correlação entre DO versus UFC.mL-1, NCV.mL-1 e [X](gL-1) é possível determinar a curva de crescimento para S. boulardii em meio permeado de soro + sais medindo somente a DO ao longo do tempo de cultivo, diminuindo assim o tempo de resposta, e também e proporcionando ajustes, se necessário, durante o processo. Em relação a secagem tem-se que para sua realização de forma eficiente, faz necessário a adição de um agente protetor para a célula, uma vez que houve perda celular durante os processos de secagem testados.
Agradecimentos

À Capes, CNPq, Fundação Araucária, e SOORO – Ingredientes LTDA.


Referências
Bylund G.(2003). Dairy processing handbook. Lund, Sweden: Tetra Pak Processing Systems AB.
Hiss, H. (2001). Cinética de processos fermentativos In: Schmidell, W.; Lima, U.A.; Aquarone, E.; Borzani, W.R (Coord.) Biotecnologia Industrial. (pp.93-122) São Paulo: Edgard Blücher.
Lee, S. S.; Robinson, F. M.; Wang, H. Y. (1981). Rapid determination of yeast viability. Biotechnology and Bioengineering, New York,11, 641-649.
Nadai, B. L. (2015). Efeito da suplementação de nutrientes e da concentração de permeado de soro de leite em fermentação descontinua utilizando Saccharomyces boulardii. Dissertação de Mestrado, Programa de Pós graduação em Engenharia Química, Universidade Estadual do Oeste do Paraná.
Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Analytical Chemistry, 31, p.426-8.
Muller, J.L. (2006). Cultivo de Saccharomyces boulardii em biorreator tipo air lift e em frascos agitados mecanicamente. Dissertação de Mestrado, Programa de Pós graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí.
Silva, N., Junqueira, V. C. A., Silveira, N. F. A.(1997). Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. São Paulo.



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