AvaliaçÃo da degradaçÃO hidrolítica e enzimática e da viabilidade celular de Dacron e ptfe usado na área cardiovascular



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AVALIAÇÃO DA DEGRADAÇÃO hidrolítica e enzimática e da viabilidade celular de Dacron e PTFE usado na área cardiovascular
Emanuelli L. C. Gracioli1, Patricia W. Rovaris3, Jonatas P. Morais3, Jeane Dullius1,2, Sandra Einloft1,2, Ana Luiza Ziulkoski3, Vanusca D. Jahno4, Rosane Ligabue1,2

1Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Tecnologia de Materiais, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

2Faculdade de Química, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

3Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Feevale, Novo Hamburgo (RS), Brasil

4Instituto de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Feevale, Novo Hamburgo (RS), Brasil

E-mail: emanuellicabral@yahoo.com.br


Resumo. Os polímeros Dacron (polietilenotereftalato) e PTFE (politetrafluoretileno) são utilizados na área médica como próteses cardiovasculares há algum tempo, embora possuam algumas limitações como trombogenicidade e calcificação. Este trabalho tem como objetivo avaliar a bioestabilidade dos materiais Dacron e PTFE frente a testes de degradação in vitro hidrolítica e enzimática, assim como, avaliar a citotoxicidade in vitro destes materiais em células fibroblásticas, NIH-3T3. Foi realizado o teste Vermelho Neutro (VN), que verifica a viabilidade lisossomal das células, em 24, 48 e 72 horas, na concentração de 100% e 50% de meio de extração (ME). Os testes de degradação in vitro hidrolítica dos materiais foram baseados na norma ASTM F1635 (2010) e os testes de degradação in vitro enzimática foram realizados baseados no método descrito na literatura. As amostras foram caracterizadas por perda de massa, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e medida de pH da solução salina. Os resultados obtidos mostraram que o Dacron e PTFE obtiveram perda de massa na degradação hidrolítica em torno de 40% e 1%, respectivamente, e na degradação enzimática, a perda de massa variou em torno de 50% para o Dacron enquanto que o PTFE não apresentou perda de massa significativa, embora suas micrografias tenham apresentado mudança nas suas superfícies. Em relação à citotoxicidade, não foram observadas alterações significativas (ANOVA de 1 via e pós-teste de Duncan) em ambas as doses (50% e 100%) e, nos diferentes tempos de exposição (24, 48 e 72 horas). Dessa maneira, o material comercial PTFE mostrou-se mais estável em relação ao Dacron e o teste de viabilidade celular indicou que os polímeros não apresentaram citotoxicidade, sendo materiais amplamente utilizados na medicina.

Palavras-chave: Bioestabilidade, Dacron, PTFE, Viabilidade lisossomal
1. INTRODUÇÃO
Muitos avanços em biomateriais poliméricos têm ocorrido na busca de melhores implantes cardiovasculares, pois grande parcela da população mundial apresenta problemas associados com esta condição [Soares, 2008; Venkatraman, 2008], além de que, a partir desses avanços possa ocorrer um aumento na expectativa e qualidade de vida da população.

Atualmente, os polímeros Dacron (polietilenotereftalato) e PTFE (politetrafluoretileno) são utilizados na área médica como próteses cardiovasculares [Cohen, 2009; Wong, 2008; Xue, 2003]. O Dacron é um poliéster aromático e linear que promove regeneração tecidual e possui um longo histórico em implantes cardiovasculares [Metzger, 1994], enquanto que o PTFE é um homopolímero não-reativo e não-tóxico quando implantado em tecidos biológicos [Catanese, 1999]. Estes materiais não sofrem deterioração biológica como implantes, fazendo a neoformação dos tecidos, embora possuam algumas limitações como trombogenicidade e calcificação [Iwai, 2004; Xue, 2003].

Este trabalho apresenta a avaliação da bioestabilidade dos materiais comerciais Dacron e PTFE frente a testes de degradação (in vitro) hidrolítica e enzimática, assim como, a avaliação da citotoxicidade in vitro destes materiais com a finalidade de verificar sua toxicidade no uso como biomaterial para regeneração tecidual.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Os dispositivos comerciais Dacron e PTFE foram cedidos como recebidos pela Faculdade de Medicina da PUCRS e caracterizados no Laboratório de Caracterização de Materiais da Faculdade de Química da PUCRS. Os testes de citotoxicidade foram feitos no Laboratório de Microbiologia Molecular do Instituto de Ciências da Saúde (ICS) da Universidade Feevale.


    1. Teste de bioestabilidade in vitro


Degradação hidrolítica

Os testes de degradação in vitro hidrolítica dos materiais foram baseados na norma ASTM F1635 (2010). As amostras foram mantidas em 10 mL de solução tampão fosfato salino, PBS, à 37 ºC dentro de tubos de ensaio em um banho termostatizado e retiradas em tempos pré-determinados (7, 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 e 270 dias). Após, são lavadas com água destilada e secas sob vácuo até obterem massa constante, para posterior caracterização por perda de massa, MEV e medida de pH da solução salina.



Degradação enzimática

Os testes de degradação in vitro enzimática foram realizados baseados no método descrito na literatura [Peng, 2010], onde as amostras foram colocadas em tubos de ensaio com 10 mL de solução tampão fosfato salino, PBS, (pH 7,4) contendo lipase pancreática de porco em uma concentração de 0,1 mg/mL e azida sódica (0,02% p/v) como agente bacteriostático. A solução salina foi trocada todo o dia para manter a atividade da enzima. Os tubos de ensaio foram mantidos a 37 °C em um banho termostatizado e retirados em 30 dias. Após, as amostras foram lavadas com água destilada e secas à vácuo até obterem massa constante, para posterior caracterização por perda de massa, MEV e medida de pH da solução salina.



2.2 Avaliação da citotoxicidade in vitro

A linhagem celular utilizada para verificar a viabilidade dos materiais foi a 3T3-NIH, células fibroblásticas provenientes de camundongo. Foram utilizadas amostras dos materiais comerciais com área de 0,5 cm2, as quais permaneceram 24 horas em 5,0 mL de meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (SFB). Os meios assim obtidos foram denominados meio de extração (ME), e foram utilizados a 100% ou misturados com igual volume de meio padrão (DMEM), obtendo-se ME a 50%, para ambos os polímeros avaliados.

As células utilizadas foram plaqueadas na densidade de 1x103 células por poço em placa de 96 poços. O teste foi realizado em 24, 48 e 72 horas, na concentração de 100% e 50% de meio de extração (ME), com renovação de meio a cada 24 horas. Paralelamente, também foram mantidas culturas apenas no meio de cultivo padrão (DMEM), utilizadas como controles de viabilidade celular. Ao final das 72 horas de exposição, as culturas foram submetidas aos ensaios de citotoxicidade do Vermelho Neutro (VN), o qual verifica a viabilidade lisossomal celular.

Todas as amostras foram feitas em triplicata e os dados obtidos foram tratados com teste estatístico ANOVA de 1 via e as diferenças foram avaliadas pelo pós-teste de Duncan (p <0,05).


3. RESULTADOS E DISCUSSÃO


    1. Caracterização da bioestabilidade

A Fig. 1 mostra a perda de massa das amostras dos materiais comerciais Dacron e PTFE sob ação da degradação hidrolítica.


a)

b)


Figura 1 – Variação da massa (%) dos materiais a) Dacron e b) PTFE com o tempo de degradação hidrolítica (0 a 270 dias).

De acordo com a Fig.1a, pode-se observar que o Dacron apresentou perda de massa em torno de 40%, embora o polietilenotereftalato (material do qual o Dacron é feito) seja considerado estável na degradação por hidrólise [Cohen, 2009; Wong, 2008]. Esta perda de massa pode estar relacionada com a presença de algum aditivo (como plastificante) no processamento deste material comercial. Ao contrário, o PTFE (Fig.1b) não mostrou variações significativas de massa (até 2%). Segundo Xue e colaboradores (2003) a superfície do PTFE é eletronegativa, o que minimiza sua degradação. Em relação a degradação enzimática, o Dacron mostrou perda de massa de 52%, enquanto que o PTFE não apresentou perda de massa, da mesma forma como na degradação hidrolítica.

O gráfico da Fig. 2 apresenta o comportamento do pH das soluções em que os materiais comerciais estavam imersos, relacionando-os com a solução branco (exposta às mesmas condições, porém, somente com PBS).
a)

b)


Figura 2 – Variação do pH das soluções da degradação hidrolítica (0 a 270 dias) dos materiais a) Dacron e b) PTFE.
Foi possível observar que o pH das soluções em que os materiais comerciais estavam imersos mantiveram-se em torno de 7,0, embora tenham apresentado variações nos valores ao longo do tempo de degradação, inclusive a solução branco. Isto se deve a variações que ocorrem desde o preparo das amostras até mudanças na temperatura ambiente.

A análise da morfologia dos filmes antes e após o período de degradação foi realizada por meio de MEV, mostrado na Fig. 3.

a)

b)


Figura 3 – Micrografia dos materiais a) Dacron e b) PTFE; antes (esquerda) e após (direita) 270 dias de degradação hidrolítica; com aumento de 1000x.
Os materiais comerciais, embora, teoricamente, estáveis à degradação [Cohen, 2009], apresentaram uma modificação significativa na estrutura das fibras originais após 270 dias sob ação da degradação, mostrando que ocorreu um ataque superficial dos materiais com surgimento de particulado no caso do Dacron (Fig. 3a, direita) e desaparecimento das interligações entre as fibras no caso do PTFE (Fig. 3b, direita).


    1. Caracterização da citotoxicidade in vitro

O teste Vermelho Neutro (VN) utilizado para verificar a viabilidade celular dos materiais comerciais, Dacron e PTFE, é mostrado na Fig. 4.


a)

b)
Figura 4 – Viabilidade celular do a) Dacron e b) PTFE; após 24, 48 e 72 horas de cultura em contato com 50 e 100% de ME
No ensaio de incorporação do VN, o qual detecta alterações na viabilidade lisossomal, observa-se que não existe diferença significativa entre os grupos testados, ou seja, não há indicativo de efeito citotóxico em ambas as doses (50% e 100%) e, nos diferentes tempos de exposição (24, 48 e 72 horas).
4. CONCLUSÕES
O material comercial PTFE mostrou ser estável ao teste de degradação ao longo do tempo, enquanto que o material Dacron apresentou grande perda de massa, que pode estar relacionado com o processamento deste a fim da obtenção de sua forma final de uso. Ambos mostraram serem materiais não citotóxicos, embora estudos indiquem problemas associados com a biocompatibilidade do Dacron com o tempo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à PUCRS, Universidade Feevale, CAPES e à A.S.Technology pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
1. ASTM F1635. Standard Test Method for in vitro Degradation Testing of Hydrolytically Degradable Polymer Resins and Fabricated Forms for Surgical Implants, 2010.

2. Banco de Saúde. Disponível em: . Acesso em: 16 setembro 2010.

3. Bernacca, G. et al. Biomaterials 23, 1 (2002) 45.

4. Catanese, J. et al. J Biomed Mater Res (Appl Biomater) 48, 2 (1999) 187.

5. Cohen, I. Disponível em: . Acesso em: 10 agosto 2009.

6. Gorna, K.; Gogolewski, S. Polymer Degradation and Stability 75, 1 (2002) 113.

7. ISO 10993-5. Biological evaluation of medical devices. Part 5: Tests for cytotoxicity: in vitro methods, 1999.

8. Iwai, S. et al. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 128, 3 (2004) 187.

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10. Ligabue, R. et al. Processo de produção de membranas biopoliméricas e membranas biopoliméricas obtidas por tal processo. BR000220904837456. B01D67/00. PI0902480-8A2. 31 jul. 2009.

11. Metzger, A. Journal of Polymer Science (Part A) Polymer Chemistry (1994) 1.

12. Meyer, E. et al. Clinical Anatomy, Original Communication 20, 4 (2007) 448.

13. Nair, L.; Laurencin, C. Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 762.

14. Peng, H. et al. Polymer Degradation and Stability 95, 4 (2010) 643.

15. Soares, J. F. S. Constitutive Modeling for Biodegradable Polymers for Application in Endovascular Stents. Texas. 2008. 301p. Dissertação (Mestrado em Filosofia). Texas A&M University, Estado Unidos da América.

16. USP 23, NF 18. Organic Volatiles Impurities, 1995.

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18. Wong, J. The application and characteristics of Dacron vascular graft, 28p, Curso de Biomateriais, 2008.

19. Xue, L.; Greisler, H. Journal of Vascular Surgery, 37, 2 (2003) 472.
EVALUATION OF THE HYDROLYTIC AND ENZYMATIC DEGRADATION AND THE CELL VIABILITY OF DACRON AND PTFE USED IN THE CARDIOVASCULAR AREA
Emanuelli L. C. Gracioli1, Gustavo B. Lucena3, Patrícia W. Rovaris4, Jeane Dullius1,2, Sandra Einloft1,2, Ana Luiza Ziulkoski4, Vanusca D. Jahno5, Rosane Ligabue1,2

1Postgraduate in Engineering and Materials Technology, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

2Faculty of Chemistry, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

3Faculty of Chemical Engineering, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

4Institute of Health Sciences, Feevale University, Novo Hamburgo (RS), Brasil

5Institute of Exact Sciences and Technology, Feevale University, Novo Hamburgo (RS), Brasil

E-mail: emanuellicabral@yahoo.com.br



Abstract. The polymers Dacron (polyethylene terephthalate) and PTFE (polytetrafluoroethylene) are used in medicine as cardiovascular prostheses for some time, although they have some limitations as thrombogenicity and calcification. This study aims to evaluate the biostability of Dacron and PTFE materials doing hydrolytic and enzymatic in vitro degradation tests, as well as to evaluate the in vitro cytotoxicity of these materials in fibroblastic cells, NIH-3T3. The test performed was Neutral Red (VN), which checks the lysosomal viability of the cells in 24, 48 and 72 hours, at a concentration of 100% and 50% extraction medium (ME). The hydrolytic in vitro degradation tests of the materials were based on ASTM F1635 (2010) and the enzymatic in vitro degradation tests were based on method described in the literature. The samples were characterized by mass loss, scanning electron microscopy (MEV) and pH measurement of the saline solution. The obtained results showed that Dacron and PTFE had mass loss in the hydrolytic degradation of around 40% and 1%, respectively, and in the enzymatic degradation, the mass loss was approximately 50% for Dacron, while PTFE not showed significant mass loss, although their micrographs have shown changes in their surfaces. Regarding the cytotoxicity, no significant changes were observed (One-way ANOVA and Duncan post-test) in both doses (50% and 100%) and in the various exposure times (24, 48 and 72 hours). Thus, the commercial material PTFE was more stable compared to Dacron and cell viability test indicated that the polymers showed no cytotoxicity, and materials widely used in medicine.
Keywords: Biostability, Dacron, PTFE, Lysosomal viability
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