AvaliaçÃo da bioestabilidade e citotoxicidade de poliuretano com potencial uso na área cardiovascular



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AVALIAÇÃO DA BIOESTABILIDADE E CITOTOXICIDADE DE POLIURETANO COM POTENCIAL USO NA ÁREA CARDIOVASCULAR
Emanuelli L. C. Gracioli1, Gustavo B. Lucena3, Patrícia W. Rovaris4, Jeane Dullius1,2, Sandra Einloft1,2, Ana Luiza Ziulkoski4, Vanusca D. Jahno5, Rosane Ligabue1,2

1Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Tecnologia de Materiais, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

2Faculdade de Química, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil 3Faculdade de Engenharia Química, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

4Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Feevale, Novo Hamburgo (RS), Brasil

5Instituto de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Feevale, Novo Hamburgo (RS), Brasil

E-mail: emanuellicabral@yahoo.com.br


Resumo. Avanços em biomateriais poliméricos têm ocorrido na busca de melhores implantes cardiovasculares, que promovam a cicatrização de vasos vasculares sem a presença de efeito citotóxico, pois grande parcela da população mundial apresenta problemas associados com esta condição. O presente trabalho apresenta o estudo da bioestabilidade de poliuretano de alta massa molar (Mw=225571g/mol), por meio de testes de degradação hidrolítica e enzimática (in vitro), como também, a avaliação da sua citotoxicidade in vitro, através de teste de viabilidade celular (teste Vermelho Neutro). Os testes de degradação hidrolítica foram baseados na norma ASTM F1635 (2010), assim como, os testes de degradação enzimática, utilizando lipase pancreática de porco, foram baseados no método descrito por Peng e colaboradores (2010), onde as amostras do poliuretano apresentaram perda de massa em torno de 4 e 5%, respectivamente. O pH das soluções em que os materiais estavam imersos manteve-se em torno de 7,0 e a morfologia dos filmes apresentou diferenças em sua superfície ao longo do tempo de degradação. A avaliação da citotoxicidade in vitro do poliuretano foi realizada utilizando células fibroblásticas NIH-3T3 durante um período de exposição de 24, 48 e 72 horas nas concentrações de 50 e 100% de meio de extração (ME), mostrando valores analisados pela estatística (ANOVA de 1 via e pós-teste de Duncan) que não demonstraram diferenças significativas, ou seja, não havendo indicativo de efeito citotóxico. Dessa maneira, é possível concluir que o poliuretano estudado apresentou resultados que mostram sua grande potencialidade na utilização cardiovascular, como estabilidade durante o período de exposição aos testes de biodegradação e, sobretudo, pelo fato deste material não apresentar toxicidade.

Palavras-chave: Biomaterial, Bioestabilidade, Citotoxicidade, Poliuretano
1. INTRODUÇÃO
A busca por melhor qualidade de vida da população tem levado ao desenvolvimento de materiais que possam substituir ou restaurar tecidos ou funções danificadas do corpo [Venkatraman, 2008]. Levando em consideração que doenças cardiovasculares são as principais causas de morte no Brasil [Banco de Saúde, 2010], um grande número de pesquisas tem sido feitas no desenvolvimento de dispositivos biocompatíveis que possuam eficácia na regeneração cardíaca, promovendo a cicatrização de vasos vasculares sem a presença de efeitos citotóxicos.

Hoje em dia, os materiais sintéticos mais utilizados para fabricação de próteses vasculares são o Dacron (polietilenotereftalato) e o PTFE (politetrafluoroetileno) [Cohen, 2009; Wong, 2008; Xue, 2003], contudo, o desenvolvimento de poliuretanos mostra-se como uma interessante alternativa para substituir e melhorar esses materiais já existentes, devido a sua excelente biocompatibilidade e propriedades mecânicas [Nair, 2007]. As características de um poliuretano dependem diretamente da natureza do isocianato e do poliól utilizados na síntese, podendo ser preparado para aplicações específicas através da variação de parâmetros como: extensão, distribuição de segmentos flexíveis e rígidos, massa molar ou grau de ramificação nas cadeias [Meyer, 2007; Bernacca, 2002], entre outros.

O presente trabalho apresenta o estudo da bioestabilidade de poliuretano de alta massa molar (Mw=225571g/mol), por meio de testes de degradação hidrolítica e enzimática (in vitro), como também, a avaliação da sua citotoxicidade in vitro, através de teste de viabilidade celular.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O poliuretano foi sintetizado por meio de uma única etapa, baseado em método já descrito na literatura [Ligabue, 2009], a partir da reação entre o poliól policaprolactona diol (PCL) e os diisocianatos hexametileno (HDI) e diciclohexilmetileno (H12MDI) em meio solvente (MEK), utilizando DBTDL (0,1% p/p) como catalisador e mantendo a temperatura reacional em torno de 50 °C.


    1. Teste de bioestabilidade in vitro


Degradação hidrolítica

Os testes de degradação hidrolítica destes materiais foram baseados na norma ASTM F1635 (2010), onde os filmes do poliuretano, após serem esterilizados por óxido de etileno, foram imersos em solução tampão fosfato salino, PBS, (pH 7,4) em tubos de ensaio. Estes tubos foram expostos a um banho termostatizado a 37 ºC e retirados em 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 dias. Após, as amostras foram lavadas com água destilada e secas a vácuo até massa constante. Posteriormente, foi feita a caracterização por perda de massa, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e medida de pH da solução salina.



Degradação enzimática

Os testes de degradação enzimática foram realizados baseados no método descrito na literatura por Peng e colaboradores (2010), onde filmes das amostras de poliuretano, após esterilização por óxido de etileno, foram colocadas em tubos de ensaio com 10 mL de solução tampão fosfato salino, PBS, (pH 7,4) contendo lipase pacreática de porco em uma concentração de 0,1 mg/mL e azida sódica (0,02% p/v) como agente bacteriostático. A solução salina foi trocada todo o dia para manter a atividade da enzima. Os tubos de ensaio foram mantidos a 37 °C em um banho termostatizado e retirados em 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias. Após, as amostras foram lavadas com água destilada e secas a vácuo até massa constante, para posterior caracterização por perda de massa, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e medida de pH da solução salina.





    1. Avaliação da citotoxicidade in vitro

O teste realizado para verificar a citotoxicidade in vitro do poliuretano foi desenvolvido através do método de contato indireto e por meio de extração (ME), baseado na ISO 10993-5 (1999), em que, uma amostra do material permaneceu 24 horas em 5 mL de meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) com 10% de SFB (Soro Fetal Bovino) e, esta solução obtida denominada ME, foi colocada em contato com as células a 100% ou misturado com igual volume de meio DMEM, obtendo-se ME a 50%. A linhagem celular utilizada foi a NIH-3T3, células fibroblásticas de camundongo, que foram plaqueadas em quatriplicata na densidade de 4x103 por poço em placas de cultura de 24 poços. Após o período de incubação (24, 48 e 72 horas) as células expostas ao ME foram comparadas com o controle e avaliadas quanto à morfologia e atividade metabólica pelo teste Vermelho Neutro (VN), o qual verifica a viabilidade lisossomal das células.

Todas as amostras foram feitas em triplicatas e os dados obtidos foram tratados com teste estatístico ANOVA de 1 via e as diferenças foram avaliadas pelo pós-teste de Duncan (p <0,05).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO


    1. Caracterização da bioestabilidade

A Fig. 1 mostra a perda de massa e diminuição da massa molar das amostras de filmes do poliuretano sob ação da degradação hidrolítica (Fig. 1a) e enzimática (Fig. 1b).


a)

b)


Figura 1 – Variação da massa (%) e da massa molar Mw (g/mol) do poliuretano com o tempo de degradação a) hidrolítica (0 a 210 dias) e b) enzimática (0 a 30 dias).
Pode-se observar que o polímero poliuretano apresentou pequena variação na perda de massa quando submetido à ação da degradação hidrolítica (Fig.1a), em torno de 4% em 210 dias de análise. Apesar de o poliuretano ser formado por um poliéster diol, a policaprolactona, a mesma é conhecida por sua biodegradabilidade lenta [Gorna, 2002]. Em relação à ação da degradação enzimática (Fig.1b), foi possível observar uma perda de massa em torno de 5%.

O gráfico da Fig. 2 apresenta o comportamento do pH das soluções em que o poliuretano estava imerso, relacionando-os com a solução branco (exposta às mesmas condições, porém, somente com PBS).


a)

b)


Figura 2 – Variação do pH das soluções da degradação dos filmes a) hidrolítica (0 a 210 dias) e b) enzimática (0 a 30 dias).
Ao longo do tempo de exposição, observou-se que os meios de degradação, tanto hidrolítica (Fig. 2a) como enzimática (Fig. 2b), não sofrerem variação significativa apresentando um pH em torno de 7,0. Este resultado mostra que os produtos de degradação não afetam o pH do meio, o que é muito interessante, pois a queda no pH é frequentemente citado como uma desvantagem sobre a degradação de implantes [Gorna, 2002]. Também se observou variações nos seus valores (Fig. 2a), inclusive a solução branco, sendo que isto se deve a variações que ocorrem desde o preparo das amostras até mudanças na temperatura ambiente.

A análise da morfologia dos filmes antes e após o período de degradação foi realizada por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), mostrado na Fig. 3.


a)

b) c)


Figura 3 – Micrografia do poliuretano a) antes, b) após 210 dias de degradação hidrolítica e c) após 30 dias de degradação enzimática; com aumento de 1000x.
A Fig. 3 apresenta as variações ocorridas na morfologia da superfície do PU após 210 dias (Fig. 3b) sob ação da degradação hidrolítica e após 30 dias (Fig.3c) sob ação da degradação enzimática, onde, observou-se diferença no tamanho dos poros e diminuição dos domínios das esferulitas, mostrando uma degradação superficial do material.


    1. Caracterização da citotoxicidade in vitro

A viabilidade celular do poliuretano foi avaliada pelo ensaio de incorporação do VN após 24, 48 e 72 horas e em diferentes concentrações (50 e 100%), mostrado na Fig. 4.



Figura 4 – Viabilidade celular após 24, 48 e 72 horas de cultura em contato com 50 e 100% de ME do poliuretano
Em relação aos valores apresentados na Fig. 4, a estatística mostra que não há diferença significativa entre os grupos testados, quando comparados ao controle negativo (meio DMEM), ou seja, não há indicativo de efeito citotóxico. Além disso, sua viabilidade celular mostrou-se superior a 80%, permitindo classificar as amostras do PU como não citotóxicas, de acordo com a norma USP 23 (1995).
4. CONCLUSÕES
O poliuretano estudado apresentou grande potencialidade na utilização em implantes cardiovasculares, devido a sua estabilidade durante o período de exposição aos testes de biodegradação e, sobretudo, pelo fato deste material não apresentar toxicidade.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à PUCRS, Universidade Feevale, CAPES e à A.S.Technology pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
1. ASTM F1635. Standard Test Method for in vitro Degradation Testing of Hydrolytically Degradable Polymer Resins and Fabricated Forms for Surgical Implants, 2010.

2. Banco de Saúde. Disponível em: . Acesso em: 16 setembro 2010.

3. Bernacca, G. et al. Biomaterials 23, 1 (2002) 45.

4. Cohen, I. Disponível em: . Acesso em: 10 agosto 2009.

5. Gorna, K.; Gogolewski, S. Polymer Degradation and Stability 75, 1 (2002) 113.

6. ISO 10993-5. Biological evaluation of medical devices. Part 5: Tests for cytotoxicity: in vitro methods, 1999.

7. Li, S. et al. Biomacromolecules 4, 2 (2003) 372.

8. Ligabue, R. et al. Processo de produção de membranas biopoliméricas e membranas biopoliméricas obtidas por tal processo. BR000220904837456. B01D67/00. PI0902480-8A2. 31 jul. 2009.

9. Meyer, E. et al. Clinical Anatomy, Original Communication 20, 4 (2007) 448.

10. Nair, L.; Laurencin, C. Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 762.

11. Peng, H. et al. Polymer Degradation and Stability 95, 4 (2010) 643.

12. USP 23, NF 18. Organic Volatiles Impurities, 1995.

12. Venkatraman, S.; Boey, F.; Lao, L. Prog. Polym. Sci. 33 (2008) 853.

14. Xue, L.; Greisler, H. Journal of Vascular Surgery, 37, 2 (2003) 472.

15. Wong, J.. The application and characteristics of Dacron vascular graft, 28p, Curso de Biomateriais, 2008.

BIOSTABILITY AND CYTOTOXICITY EVALUATION OF POLYURETHANE WITH POTENCIAL USE IN THE CARDIOVASCULAR AREA
Emanuelli L. C. Gracioli1, Gustavo B. Lucena3, Patrícia W. Rovaris4, Jeane Dullius1,2, Sandra Einloft1,2, Ana Luiza Ziulkoski4, Vanusca D. Jahno5, Rosane Ligabue1,2

1Postgraduate in Engineering and Materials Technology, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

2Faculty of Chemistry, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

3Faculty of Chemical Engineering, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre (RS), Brasil

4Institute of Health Sciences, Feevale University, Novo Hamburgo (RS), Brasil

5Institute of Exact Sciences and Technology, Feevale University, Novo Hamburgo (RS), Brasil

E-mail: emanuellicabral@yahoo.com.br



Abstract. Advances in polymeric biomaterials have been in search of better cardiovascular implants that promote the cicatrization of vascular vessels without the presence of cytotoxic effect, because a large portion of the world population has problems associated with this condition. This paper presents the study about the biostability of a polyurethane with high molecular mass (Mw=225571g/mol), by hydrolytic and enzymatic biodegradation tests (in vitro), as well as the evaluation of the in vitro cytotoxicity, through of cell viability (Neutral Red test). The hydrolytic tests were based on standard ASTM F1635 (2010), even as the enzymatic tests using porcine pancreatic lipase, were based on the method described by Peng and coworkers (2010), in which the polyurethane samples presented mass loss around 4 and 5%, respectively. The pH of the solutions where the samples were immersed maintained around 7,0 and the films morphology presented differences on their surfaces during the time degradation. The in vitro cytotoxicity evaluation of the polyurethane was performed using NIH-3T3 fibroblastic cells during an exposure time of 24, 48 and 72 hours on the concentrations of 50 and 100% of extraction medium (ME), showing values analyzed by statistical (One-way ANOVA and Duncan post-test) that did not demonstrated significant differences, in other words, without indicative of cytotoxic effect. Thus, it is possible to conclude that the studied polyurethane presented results that show its great potential in the cardiovascular use, with stability during the exposure time of the biodegradation tests and, mainly, to the fact that this material doesn’t present toxicity.
Keywords: Biomaterial, Biostability, Cytotoxicity, Polyurethane
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