Atividade tripanosomicida e estudo do perfil cromatográfico dos extratos das folhas e das sementes de Lonchocarpus cultratus L



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Atividade tripanosomicida e estudo do perfil cromatográfico dos extratos das folhas e das sementes de Lonchocarpus cultratus L.
Luiza Stefanello(PIBIC/CNPq/Unioeste), Tereza Cristina Marinho Jorge(Orientador). e-mail: tcmjorge@gmail.com
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas/Cascavel, PR.
Grande área e área: Ciências da Saúde - Farmácia.
Palavras-chave: Fitoquímica, Cromatografia, Tripanosoma cruzi.
Resumo
Doença de Chagas é uma infestação comum na América Latina, de difícil diagnóstico e tratamento limitado. A rotenona, metabólito secundário inseticida, encontrada na raiz de L. cultratus é frequentemente utilizada contra parasitas. Porém, há poucos estudos fitoquímicos com as folhas e sementes dessa espécie. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar uma possível atividade tipanosomicida das folhas e sementes dessa planta. Os testes fitoquímicos foram positivos para rotenona no extrato bruto das sementes, metabólito responsável pela atividade tripanosomicida positiva.
Introdução
A Doença de Chagas ou tripanossomíase americana é causada pelo Tripanosoma cruzi. A doença é um sério problema de saúde pública, porque frequentemente é diagnosticada na fase crônica, na qual ocorre comprometimento de órgãos importantes, como coração e fígado. É uma infestação comum na América Latina, sua transmissão ocorre por picada do mosquito vetor, transfusão sanguínea ou congênita. O tratamento da tripanossomíase é mais eficaz na fase aguda, geralmente assintomática, porém o diagnóstico acontece na maioria das vezes, na fase crônica, quando o paciente encontra-se em estado avançado da doença. Existem somente dois medicamentos para tratar essa doença: o benzonidazol e nifurtimox. Ambos apresentam eficácia limitada e diversos efeitos colaterais na fase crônica, e não encontram-se disponíveis no comércio (Rassi et al., 2012). Assim, a pesquisa por novas drogas contra essa doença é muito importante, dada a escassez de medicamentos e a grande biodiversidade brasileira.

O gênero Lonchocarpus é conhecido por apresentar grande variedade de flavonóides, classe de metabólitos secundários produzidas por vegetais e com reconhecido valor terapêutico. Vários flavonóides apresentam ação antioxidante, anti-inflamatória, antialérgicos, antitrombóticos, vasoprotetores e antineoplásicos (Evans, 1996), citotóxica (Pires, 2001 apud Cunha, 2003) e antimalárica (Pires, 2011 apud Khaomek, 2008). Nesse gênero, também foram isolados e identificados outros metabólitos secundários, os rotenóides, cuja principal representante é a rotenona. Substâncias utilizadas como inseticidas e anestésicas temporárias, auxiliando na captura de peixes (Viegas Jr., 2003). A rotenona é frequentemente encontrada nas raízes de plantas do gênero Lonchocarpus, porém não existem estudos de sua atividades tripanosomicida e, poucos estudos fitoquímicos e de atividade biológicas utilizando suas folhas e sementes. A falta de pesquisas com as plantas do gênero Lonchocarpus e a escassez de drogas tripanosomicidas levaram a realização deste trabalho, cujos objetivos serão investigar a atividade tripanosomicida do extrato das folhas e sementes de Lonchocarpus cultratus L., bem como caracterizar os extratos por cromatografia de camada fina (CCF) e testes fitoquímicos.


Materiais e Métodos
Coleta e identificação

A coleta da planta foi realizada no Lago Municipal de Cascavel no dia 9 de março de 2014, com clima ensolarado e temperatura na faixa de 26˚C. O material coletado foi seco, em estufa de ar circulante, em temperatura menor que 40˚C e, posteriormente, triturado em moinho de facas, do tipo Willye. O material seco e triturado foi pesado, totalizando 20,093 g de sementes trituradas e 354,015 g de folhas trituradas. Uma amostra do material vegetal foi separada para a identificação botânica, realizada pela Profa. Dra. Livia Godinho Temponi, bióloga da UNIOESTE. Uma exsicata foi depositada no Herbáreo da Unioeste com o no. UNOP 20.


Obtenção dos Extratos: folhas e sementes

As folhas e sementes trituradas foram submetidas ao processo de evaporação exaustiva em 1 L de metanol para as folhas e 100 mL para as sementes. A evaporação do solvente foi realizada em rotaevaporador, empregando pressão reduzida. Ao final do processo, os extratos foram pesados totalizando 89,281 g de extrato bruto das folhas e aproximadamente 5 g das sementes.


Testes fitoquímicos

Foram realizados os seguintes testes fitoquímicos com os extratos bruto obtidos: os flavonoides foram testados através da Reação de Shinoda; os taninos por meio da reação de cloreto férrico; as cumarinas foram detectadas pela reação com KOH/UV; os triterpenos e esteroides pela reação de Liebermann-Burchard; as saponinas pela reação de espuma; os alcaloides pelo reagente de Dragendorff e de Mayer e as antraquinonas pela reação de Borntraeger.


Cromatografia em Camada Fina (CCF)

Nas placas de CCF foram aplicados spots dos extratos bruto das folhas e sementes. Os spots foram aplicados 1 cm acima da borda inferior da placa, com auxílio de capilares. As fases móveis utilizadas foram 40 mL de diclorometano (CH2Cl2) e solução de diclorometano : metanol (MeOH) 10%. Esses eluentes apresentavam diferentes polaridades, cuja finalidade foi analisar a polaridade dos constituintes. Após a corrida cromatográfica, os constituintes foram revelados com iodo metálico.


Teste de Atividade Tripanosomicida

Formas epimastigotas de Tripanosoma cruzi foram cultivados em meio LIT (Liver Infusion Triptose). Tubos do tipo Falcon foram utilizados para a realização do teste. Tubos controle foram utilizados para comparar os resultados de atividade tripanosomicida do extrato bruto das folhas e sementes.

O esquema a seguir explica a metodologia dos ensaios:

I. Tubos controle: Controle branco (sem extrato) - meio LIT e T. cruzi; controle negativo - meio LIT, DMSO e T. cruzi

II. Tubos com extrato bruto das folhas e sementes nas seguintes concentrações: 1 μg.mL-1,10 μg.mL-1, 15 μg.mL-1, 50 μg.mL-1, 100 μg.mL-1, 150 μg.mL-1, 175 μg.mL-1.

Uma suspensão de 1x10-5 Tripanosoma cruzi.mL-1 (equivalente a 18 μL), meio LIT e extrato vegetal foram adicionados nos tubos utilizados no teste até se completar o volume de 3mL. O extrato bruto das folhas em cada tubo foi empregado em concentrações diferentes: 175, 150, 100, 50, 15, 10 e 1 μg.mL-1. O teste foi realizado em triplicata para cada concentração de extrato bruto empregada.

A seguir, os tubos foram incubados à 27 ̊C por 72 horas. Após este tempo, procedeu-se o cálculo das médias de crescimento dos protozoários, através da contagem do número de parasitas nos quadrantes de câmara de Neubauer.
Resultados e Discussão
Tabela 1 - Resultado dos testes fitoquímicos dos extratos de L. cultratus


Metabólito Secundário

Resultado Folhas

Resultado Sementes

Saponinas

-

-

Flavonoides

-

-

Taninos

-

-

Alcaloides

-

-

Antraquinonas

-

-

Esteroides e triterpenos

-

+

Cumarinas

-

-

O teste fitoquímico foi positivo para esteroides e triterpenos (Tabela 1), metabólitos secundários responsáveis pela ação tripanosomicida do extrato de L. cultratus, atividade demonstrada na Tabela 2.

Ao revelar a cromatografia de camada fina observou-se que o aumento da polaridade da fase móvel, promoveu melhor separação dos constituintes do extrato das folhas, que são mais polares, em relação aos componentes das sementes. O extrato das sementes, no entanto, não respondeu bem aos solventes polares, seus spots se fundiram, atrapalhando na separação.

Tabela 2 - Teste de atividade tripanosomicida com extrato bruto das folhas e sementes


Concentração extrato bruto (μg.mL-1)

Média de T. cruzi nos quadrantes da câmara de Neubauer - Extrato Folhas

Média de T. cruzi nos quadrantes da câmara de Neubauer - Extrato Sementes

1

152,58

43,30

10

137,58

38,50

15

105,33

33,42

50

146,33

14,08

100

128,58

4,63

150

111,17

4,25

175

84,42

3,5

Controle - DMSO

81,67

34,17

Branco

108,50

51,17


Conclusões
O extrato bruto das sementes de L. cultratos tem atividade contra o T. cruzi, devido a presença dos triterpenos. No entanto, o extrato das folhas não apresentou atividade, uma vez que não produz os metabólitos secundários.
Agradecimentos
Agradeço a CNPq pela bolsa fornecida para a realização da pesquis.
Referências

De Andrade Cunha, G. M.; Fontenele, J. B.; Nobre Junior, H. V.; De Sousa, F. C. M.; Silveira, E. R.; Nogueira, N. A. P.; Moraes, M. O.; Viana, G. S. B.; Costa-Lotufo, L. V.; Phytother. Res. 2003, 17, 155.


Evans, W.C. Pharmacognosy. 40 ed. London: Saunders. 1996.
Khaomek, P.; Ichino, C.; Ishiyama, A.; Sekiguchi, H.; Namatame, M.; Ruangrungsi, N.; Saifah, E.; Kiyohara, H.; Otoguro, K.; Omura, S.; Yamada, H.; J. Nat. Med. 2008, 62, 217.
Pires, A. M. L.,. Silveira E. R., Pessoa, O. D. L. Flavonoides de Lonchocarpus campestris (Leguminosae). Quim Nova, Vol. 34, No. 2, 268-271, 2011.




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