Apostila de aula prática



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Encontro14.01.2018
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Provas bioquímicas para identificação de bacilos gram-negativos
Esta aula tem como objetivo a identificação de enterobactérias em gêneros ou espécies, através da utilização de meios de cultura especiais que possibilitam a verificação da presença de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de vários substratos. As alterações nos meios produzidas pelo metabolismo bacteriano servirão de base para sua identificação de acordo com o esquema a seguir:


  1. PLAQUEAMENTO SELETIVO

É a etapa de isolamento bacteriano a partir do espécime clínico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presença dos corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactérias Gram positivas. Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactérias Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem ácidos que dissociam este sal, apresentando-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as não fermentadoras (LAC-) formam colônias transparentes.




  1. TRIAGEM

É um conjunto de provas bioquímicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios, permitindo uma diferenciação inicial dos isolamentos e direcionamento da confirmação bioquímica posterior. Quando realizada em meio TSI (“Triple Sugar Iron”), podemos observar:



  1. Fermentação de glicose com ou sem produção de gás

Glicose  ácidos ou ácidos + gás

  1. Fermentação de sacarose e/ou lactose

Sacarose/lactose  ácidos

  1. Produção de H2S

Tiossulfato de sódio  H2S

H2S + íons férricos  sulfeto ferroso (cor negra)

Bactérias que utilizam apenas glicose provocam acidificação (cor amarela) apenas na base do tubo, permanecendo o ápice alcalino (cor vermelha). Bactérias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A produção de H2S se manifesta pelo escurecimento do meio. Vejamos os possíveis resultados da triagem:

Reações em TSI


  • Pico alcalino/fundo alcalino:

Ausência de fermentação de carboidratos. Característica de bactérias não fermentadoras. Ex.: Pseudomonas aeruginosa.

  • Pico alcalino/fundo ácido:

Fermentação de glicose; ausência de fermentação de lactose e/ou sacarose. Característica de bactérias não fermentadoras de lactose e/ou sacarose. Ex.: espécies de Shigella.

  • Pico alcalino/fundo ácido:

Fermentação de glicose; ausência de fermentação de lactose e/ou sacarose; produção de sulfeto de hidrogênio. Característica de bactérias não fermentadoras de lactose e/ou sacarose e produtoras de sulfeto de hidrogênio. Ex.: espécies de Proteus, Citrobacter e Salmonella.

  • Pico ácido/ fundo ácido:

Fermentação de glicose e lactose e/ou sacarose. Característica de coliformes fermentadores de lactose e/ou sacarose. Ex.: Escherichia coli.






  1. CONFIRMAÇÃO BIOQUÍMICA

É um conjunto de provas necessárias para a identificação bioquímica das colônias suspeitas. Algumas provas estão descritas abaixo:



  1. Fermentação de carboidratos

Este teste tem com princípio determinar a habilidade de um organismo em fermentar (degradar) um carboidrato específico incorporado em um meio básico produzindo ácido ou ácido com gás.

Os carboidratos são classificados como: (1) monossacarídeos, polihidroxialdeídos ou cetonas; (2) polissacarídeos ou oligossacarídeos (produtos formados pela condensação de 2 ou mais monossacarídeos); (3) álcoois poliídricos (produtos formados pela redução de monossacarídeos). O monossacarídeo ou açúcar simples é usualmente composto de 1 a 6 carbonos: ribose, xilose, glicose. Os dissacarídeos são polissacarídeos compostos de duas unidades de monossacarídeos. Como exemplo temos a sacarose formada pela glicose + frutose, e a lactose que é glicose + galactose.

A fermentação é um processo metabólico de oxi-redução anaeróbico onde um substrato orgânico serve como um aceptor final de hidrogênio (aceptor de elétron), no lugar do oxigênio. As bactérias fermentadoras normalmente são anaeróbicas facultativas. Através do processo de fermentação, um carboidrato é degradado em duas moléculas de três átomos de carbono, que serão metabolizadas em compostos menores. O produto final é um ácido que varia de acordo com a espécie bacteriana. No teste de utilização dos carboidratos, ao meio básico é incorporado um indicador de pH (vermelho de fenol) que irá sofrer alteração de cor com a presença de ácidos. A partir da glicose podemos observar também a produção ou não de gás (CO2, H2) no interior do tubo de Durhan. A inoculação é realizada a partir de cultura bacteriana recente; com incubação por 24 horas a 37ºC.



Resultado


Cor do meio

Positivo (+)

Amarelo

Negativo (-)

Rosa




  1. Vermelho de metila (VM)

Este procedimento visa testar a habilidade de um organismo produzir e manter estáveis produtos ácido finais, a partir da fermentação de glicose, e superar a capacidade de tamponamento do meio. Isto ajuda na diferenciação de alguns gêneros e espécies, pois algumas bactérias produzem mais ácidos que outras, logo o pH do meio será diferente. Como exemplo podemos citar a ajuda na diferenciação entre Escherichia coli (+) e Enterobacter aerogenes (-).

O teste de VM é baseado no uso de um indicador de pH, o vermelho de metila, para determinar a concentração de íons de hidrogênio presentes quando um microrganismo fermenta glicose. Os microrganismos VM positivos prodezem ácidos estáveis, mantendo alta concentração de íons de hidrogênio. Já os microrganismos VM negativos também produzem ácidos (ex.: ácido acético, ácido láctico), mas o meio possui uma baixa concentração de hidrogênio revertendo à neutralidade devido a uma posterior degradação dos ácidos orgânicos em carbonatos, em dióxido de carbono e, possivelmente, a formação de amônia a partir da proteína presente no meio.

Este teste é feito no meio de Clark & Lubs. A inoculação é idêntica ao item A. Após a incubação (48 h), devemos adicionar 3-5 gotas de Reativo de VM.



Resultado


Cor do meio

Positivo (+)

Vermelho

Negativo (-)

Amarelo




  1. Vogis & Proskauer (VP)

Este teste tem como princípio determinar a habilidade de alguns microrganismos em produzir o acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose. Esta é inicialmente metabolizada em ácido pirúvico durante a glicólise. A partir do ácido pirúvico a bactéria pode seguir várias vias metabólicas e a acetoína é um dos possíveis produtos finais da degradação da glicose. O teste de VP pode ser útil por exemplo na diferrenciação entre Klebsiella pneumoniae (+) e Enterobacter (normalmente +) de E. coli (-).

Este teste também é feito no meio de Clark & Lubs com inoculação idêntica ao item A. Após a incubação (48 h) devemos adicionar ao meio os seguintes reativos:

VP I (Barrit I): -naftol (0,6 mL)

VP II (Barrit II): KOH (0,2 mL)

A seguir agitar o tubo para oxigenar o meio e deixar descansar por 10 a 15 minutos.



Resultado


Cor do meio

Positivo (+)

Anel vermelho na superfície

Negativo (-)

Sem alteração/acobreado



D) Citrato

Este teste visa determinar se um microrganismo é capaz de utilizar citrato como uma única fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactérias citrato positivas crescem usando sais de amônia como fonte de nitrogênio, liberando amônia e consequentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH é o azul de bromotimol, que em meio ácido fica amarelo e em meio básico, azul.

Este teste é feito no meio de Citrato de Simmons e a inoculação é realizada a partir de cultura bacteriana recente, na superfície do meio.

Resultado


Cor do meio

Positivo (+)

Azul

Negativo (-)

Verde



E) Indol

Este teste tem como princípio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molécula de triptofano. Pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros de bactérias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-).

O triptofano é um aminoácido que pode ser oxidado por certas bactérias, formando três principais metabólicos indólicos: indol, metil indol e ácido indol acético. Neste processo, várias enzimas estão envolvidas, chamadas coletivamente de “triptofanases” que catalisam a reação de desaminação do triptofano produzindo o indol. Este pode então ser detectado através da adição do reativo de Kovacs, que é um aldeído. A reação do indol com o reativo de Kovacs dá origem ao produto corado.

A inoculação é igual a do item A, em meio de água peptonada a 1%. Após a incubação, devemos adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs e observar a alteração na coloração do meio.



Resultado


Cor do meio

Positivo (+)

Rosa

Negativo (-)

Amarelo



F) Mobilidade

O teste visa verificar se a bactéria é móvel ou imóvel. Logo pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros como por exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactérias é proporcionada pela presença de um ou mais flagelos. As bactérias imóveis não possuem flagelos.

O teste é realizado em meio semi-sólido e na sua inoculação devemos utilizar agulha bacteriológica, fazendo uma picada central de até ¾ da profundidade do tubo.

Resultado


Cor do meio

Positivo (+)

Crescimento fora do local da picada

Negativo (-)

Crescimento ao redor da picada



G) URÉIA

Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uréia, formando duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease (uréia  2 NH3 + CO2 + H2O). Esta amônia produzida alcaliniza o meio e reage com o indicador de pH (vermelho de fenol) dando uma cor rosa ao meio.

A inoculação é idêntica a do item A, em caldo de uréia.

Resultado


Cor do meio

Positivo (+)

Vermelho/rosa

Negativo (-)

Amarelo/sem alteração


RESULTADOS ESPERADOS NOS TESTES BIOQUÍMICOS

Tabela I. Identificação bioquímica de algumas enterobactérias




Característica
E. coli
Salmonella
Klebsiella
Proteus

Enterobacter

EMB

Lac+


Lac-

Lac+

Lac-

Lac+

TSI

ác/ác

alc/ác

ác/ác

alc/ác ou ác/ác

ác/ác

H2S

-

+

-

+

-

Glicose

+

+

+

+

+

Gás

+

+

+

+

+

Lactose

+

-

+

-

+

Sacarose

V

-

+

v

+

Manitol

+

+

+

v

+

VM

+

+

+

+

-

VP

-

-

-

-

+

Citrato

-

v

+

-

+

Indol

+

-

-

v

-

Mobilidade

V

+

-

+

+

Uréia

-

-

v

+

-


­­­Legenda: (+) = positivo, (-) = negativo, (v) = variável.




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