ApelaçÃo cível nº



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Encontro14.04.2019
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A reação de PCR acontece neste equipamento chamado termociclador, em que diversas fases ocorrem. Temos a desnaturação, uma ligação de seqüências específicas para que ocorram as amplificações, e o tempo de reação é de 2h 52min para os marcadores do Kit Identifiler.

Apresenta um vídeo demonstrando a reação de PCR. Uma molécula de DNA, quando a temperatura começa a subir, se separa, num processo chamado de desnaturação, começando os ciclos da reação de PCR. As fitas separadas, com a diminuição da temperatura, as seqüências, chamadas de primer, fixam-se à molécula molde e, após a subida da temperatura, há a ligação de uma enzima, chamada taq polimerase, que vai realizar a extensão, a partir dos moldes dessa ligação vai fazer a extensão da fita complementar, encerrando o primeiro ciclo de reação. Inicia-se novamente com a fase de desnaturação, depois há a ligação dos primers na fita molde, que chamamos de anelamento, e a extensão pela taq polimerase.

Aí podem perceber que, partindo-se de uma molécula de DNA, à medida que ocorrem os ciclos, apenas regiões específicas de interesse para análise são amplificadas. Então, há uma continuidade, esses ciclos vão ocorrendo até que se tenha um número bem alto de cópias daquelas regiões.

Ao término da reação de PCR, que é uma amplificação exponencial a partir de 30 ciclos daqueles que ocorreram, há mais de um trilhão de cópias de cada região de interesse aptas a serem aplicadas em um seqüenciador automático para serem analisadas.

Agora a Simone irá complementar.

DRA. SIMONE SCHUMACHER – Boa-tarde, Continuarei a partir da parte técnica até a interpretação dos resultados propriamente ditos.

Mostra a imagem de um seqüenciador automático,dizendo que é ele que faz a análise totalmente automatizada das nossas amostras.

Após o processo do PCR, as amostras sofrem a inserção de alguns parâmetros que poderão identificar o tamanho dos fragmentos obtidos.

O seqüenciador automático mostrado possui apenas um capilar, ou seja, pode analisar apenas uma amostra por vez. O nosso tem uma capacidade muito maior, possui 16 capilares, ou seja, 16 amostras podem ser analisadas simultaneamente, conferindo-nos uma placa de 96 poços, que nos permite analisar 30 casos em aproximadamente quatro horas.

Além da análise dos fragmentos em si, do tamanho dos fragmentos, esse seqüenciador automático permite-nos a separação dos fragmentos de acordo com a sua cor de fluorescência, que são também inseridos no PCR, tornando possível a interpretação dos dados. Há fluorescências azul, verde, amarela, vermelha e mais a laranja, que é o nosso marcador.

O Kit Identifiler tem quatro regiões na fluorescência azul, cinco regiões na fluorescência verde, quatro regiões na fluorescência amarela, dois marcadores de fluorescência vermelhos, mais a amelogenina, que é no cromossoma sexual.

Temos também um kit de apoio, da Promega, que possui o Penta D e o Penta E, usado em casos em que o suposto pai é falecido ou apresenta alguma peculiaridade e precisamos aumentar o número de marcadores para obter um resultado mais conclusivo. Na prática, também usamos o sistema PowerPlex, mas rotineiramente usamos apenas o Kit Identifiler.

Aqui, a entrada no seqüenciador automático, uma amostra passando por um capilar onde vai ser aplicado um potencial elétrico. Os fragmentos serão separados de acordo com seus tamanhos, ou seja, os mais leves, menos pesados e mais rápidos vão passar mais rápido no capilar, enquanto que os mais pesados e maiores vão passar mais lentamente. Eles vão passar por uma janela de leitura em que há um laser que fará a leitura da fluorescência e dos tamanhos, separando todas as cores e tamanhos. Depois de todo o processamento, o dado bruto que vai aparecer são os picos. Esses dados serão utilizados na análise e na interpretação do resultado da paternidade.

No seqüenciador automático, os marcadores são parâmetros de tamanho, já que em cada um dos marcadores de DNA, em cada uma das regiões do DNA aparecem todas as possibilidades de alelos. O seqüenciador, na sua automatização, para identificar todos os fragmentos que vai fazer, precisa da coleta dos dados após a passagem pela eletroforese capilar.

A interpretação do resultado é o que realmente nos interessa, então vou analisar um caso típico de trio - mãe, filho e suposto pai – em que o material biológico foi uma amostra sanguínea. Assim, após a extração, após o PCR, após a eletroforese, vamos fazer a análise.

Vou demonstrar um caso de inclusão de paternidade. É importante dizer que até a parte do seqüenciador, até a parte do dado bruto, é feito tudo automaticamente no seqüenciador.

Agora, entra a interpretação do perito, que é muito importante, porque consegue realmente avaliar a inclusão ou a exclusão da paternidade e o caminho que vai tomar a amostra, se será liberada, se será repetida, se tem algum problema. Então, entra o trabalho humano, que ainda não foi substituído pela máquina, e espero que não seja tão cedo.

Temos um marcador de fluorescência azul, temos a linha da mãe, a linha com a amostra do filho e a linha com a amostra do suposto pai. Os picos são os picos de DNA encontrados para cada um desses marcadores - há o D8, o D21, o D7 e o CSF1PO -, temos representadas quatro regiões do azul. Olhamos primeiramente o que o filho esta recebendo da sua mãe, porque, na verdade, a mãe é sempre a certeza.

Então, partimos dela para fazer a análise. Buscamos o alelo 14 e verificamos que está vindo da mãe biológica. O outro alelo, no caso, é o 12, então buscamos uma co-relação com o homem que está sendo investigado. Para esse marcador, a co-relação está o.k.

O mesmo procedimento é realizado no alelo seguinte, 32.2, que está vindo da sua mãe; o alelo 31 está sendo encontrado no suposto pai.

No outro marcador, igualmente, o alelo 13 vindo da mãe, e o alelo paterno obrigatório, 11, sendo encontrado neste suposto pai. Para o outro caso também, o alelo 12 vindo da sua mãe, e o 10, alelo paterno obrigatório, presente no homem.

Por uma fluorescência amarela também temos as quatro regiões sendo representadas. O filho é homozigoto, significa que ele está recebendo o mesmo alelo de origem materna e o mesmo alelo de origem paterna. Ele tem os dois, mas é homozigoto, apresentando igual. Aqui, está presente na sua mãe; aqui, o alelo obrigatório presente no homem investigado. Alelos 17 e 18, a mãe é igual, 17 e 18, pode ser ou o 17 ou o 18, o alelo obrigatório, mas o pai, como tem o 17, infere-se que está passando o 17 para o seu filho. Portanto, o 18 está vindo da sua mãe.

Nos alelos 10 ou 11, o 11 é o alelo materno e o 10 obrigatório paterno. Penso que este homem não escapa mais.

Alelos 14 e 15, o 14 é materno, e o 15 está presente também. Metade já foi.

Na fluorescência verde, o mesmo procedimento: 16 alelo materno, 16 alelo paterno, e assim por diante.

Como já sei que é uma inclusão, em todos os marcadores o pai está apresentando o alelo paterno obrigatório.

Na fluorescência vermelha, é muito importante fazermos a conferência, o cromossoma sexual dá a certeza de que a mãe tem que ser xx - se aparecer xy teremos que rever todos os nossos conceitos e voltar em todas as nossas análises -, e o suposto pai, obrigatoriamente, também tem que ser xy, do contrário teremos problema.

Então, isso nos dá a confiabilidade de que está tudo certo. O sexo do filho também é confirmado no momento da correção do laudo, se o filho é um menino ou uma menina. Sempre utilizamos essas tabelas na correção do laudo.

Infelizmente ou felizmente, não sei, este homem acusado vai passar por uma análise estatística na qual o laudo vai receber uma probabilidade, indicando a percentagem de este homem ser realmente o pai biológico dessa criança e não qualquer homem ao acaso. Neste caso, a probabilidade, será acima de 99,9% com certeza.

Para a exclusão da paternidade partimos do mesmo princípio: o 11 e o 13 desse filho podem ser da mãe, mas, no caso, este pai tem o 13 e começamos bem. O 28 e 29 presentes no filho, o 29 ele está recebendo da sua mãe, e o 28 é alelo paterno obrigatório – este pai tem um 27. Não fechou. Já temos uma inconsistência. O 11 ou 12, 11 e 12 da mãe, o k. O 12 está presente no suposto pai, até aí tudo bem. O 10 de origem materna, alelo obrigatório, este pai não tem. Já são duas inconsistências nesses marcadores. O 15 fecha e o 13 não está presente neste pai. Três inconsistências. O 17 e o 19, o 19 não está presente nesse marcador. Quatro inconsistências. O 8 ou o 11, o 8 também não está presente neste suposto pai nesse marcador. Cinco inconsistências. O 14 e o 16, 16, 16. Já temos cinco inconsistências.

Três inconsistências em cromossomos diferentes já são suficientes para afirmar-se uma exclusão de paternidade, mas é muito difícil. Se encontrarmos até quatro marcadores, ainda utilizamos o outro kit para confirmação de mais inconsistências. Geralmente atingimos, no mínimo, cinco com tranqüilidade.

Já estávamos em cinco inconsistências e temos mais outra, o 18 que não é de origem materna, é de origem paterna, e este pai não apresenta. Portanto, já são seis inconsistências. O 8 também não está sendo encontrado no suposto pai, são sete. O 10, que é de origem paterna obrigatória, não está presente nesse pai, são oito inconsistências. O 11 está presente. O 18 também não está presente neste suposto pai, já são nove inconsistências. O 12, que é de origem obrigatória, está presente. Também o 25 e o 23 estão presentes. Há nove inconsistências.

Isso já é mais do que suficiente para afirmar-se a paternidade, mas não paramos aí. Primeiro, verificamos que o filho é homem, mesmo sexo do suposto pai, em análise prévia já trocamos as posições. Neste caso, trocamos o pai de posição com o filho, colocando o filho no lugar do suposto pai, para verificar se não houve uma eventual troca entre as amostras, um erro humano que pode acontecer no momento da coleta. Assim, checamos para ver se ocorreu troca.

Invertendo-se as posições, já se verifica que a mãe não está fechando com o suposto pai, o que exclui a possibilidade da troca. Quando é caso de filha mulher, invertemos a posição com a mãe para termos certeza que não houve troca de amostras na coleta.

No nosso caso, após a verificação das nove inconsistências, vai voltar para todo o procedimento, extração de nova amostra, PCR, amplificação, eletroforese capilar e, além da interpretação do dado novamente, a conferência do dado anterior. Todos os casos de exclusão de paternidade são conferidos dessa maneira.

Há casos especiais em que a mãe é falecida ou desaparecida, mas, quando a mãe está presente, ela deve fazer a coleta da amostra, porque senão não conseguimos identificar o alelo materno. Então, vamos observar o conjunto todo do filho com o pai.

Aqui, como está tendo a correlação do número 12, não podemos dizer que esse 12 é realmente de origem paterna, porque não temos a mãe para garantir isso. A presença da mãe em um exame de investigação de paternidade é muito importante, porque nos dá toda a garantia de que realmente estamos lidando com uma inclusão ou com uma exclusão de paternidade.

Para resolver casos assim, que aparecem até com uma freqüência bem grande, analisamos um número maior de marcadores para atingir uma probabilidade mais alta, porque nunca largamos com menos de 99.9% para os casos de mãe falecida ou desaparecida.

Outro recurso principalmente em casos em que o suposto pai é falecido é utilizarmos os marcadores do cromossomo y, que é de origem paterna, uma linhagem paterna, pai passando para filho o cromossomo y com todas as suas características intactas. É importante ressaltar que, ao ser analisado o cromossomo y, não podemos dizer que esse filho, tendo as características correlacionadas com o suposto pai, ou seja, sendo encontradas todas as correlações, é filho desse homem. O que podemos dizer é que eles são da mesma linhagem, porque o cromossomo y vem do seu ancestral, passando para todos os membros masculinos da mesma forma, por isso se diz que são da mesma linhagem, embora não se possa afirmar que são pai e filho.

Em casos de pai falecido isso é de grande valia, porque nos auxilia muito nos resultados. Também estamos tentando implantar no laboratório marcadores do cromossomo x para resolver problemas das meninas.

No Kit Identifiler da Applied Biosystems, que utilizamos, há as regiões analisadas para fluorescência azul, verde, amarela e vermelha. Então, temos o mesmo tipo de resultado, porque passam pelo mesmo procedimento, mesma extração de DNA; o PCR é um pouquinho diferenciado no número de ciclos, ou seja, o tipo; eletroforese capilar e a análise dos resultados da mesma maneira.

Exemplificando, temos duas amostras para comparação, e os dois têm o mesmo perfil para vários marcadores. Isso demonstra que eles são da mesma linhagem patrilínea.

O que mais interessa é a análise em si e o que fazemos com esses resultados.

Passo a palavra para o meu colega Rodrigo, que vai falar sobre a parte estatística, ou seja, como chegamos aos resultados de probabilidade em si.
DR. RODRIGO RODEMBUSCH – Boa-tarde a todos. Vou falar sobre a estatística aplicada à investigação de paternidade e vou tentar não ser maçante, porque estatística lembra cálculos, fórmulas. Então, vou tentar falar, de forma clara, como utilizamos essas fórmulas.

Existem duas grandes interpretações a respeito de probabilidade. Uma é a clássica, sustentada pelos frequencistas, que diz que a probabilidade é a freqüência de um evento em um grande número de testes, quer dizer, a freqüência relativa, o percentual de freqüência relativa de um evento em um grande número de testes. Já os bayesianos acreditam que a probabilidade é o grau de acreditação desse evento, é o poder da crença no tomador de decisão na ocorrência deste evento.

Por exemplo, no teste de probabilidade do lançamento de dados. Para os frequencistas, a probabilidade de um dado cair com a face do número um para cima é de 1/6 - uma chance em seis lados. Já para os bayesianos é diferente, seria de 1/6 a probabilidade de dar um sobre a probabilidade de dar as outras faces, exceto um, 5/6.

Há dois termos muito utilizados no teste de paternidade. Probabilidade a priori, que é a probabilidade marginal, sobre uma variável, na ausência de alguma evidência. Ou seja, é aquela probabilidade inicial, não há nenhuma evidência genética ainda, porém devemos partir de uma probabilidade inicial. Qual é a chance daquele indivíduo testado ser o pai da criança? A probabilidade a posteriori leva em consideração a probabilidade a priori mais a evidência genética, chegando aos 99,9999%. E isso é a probabilidade a posteriori.

Essas duas probabilidades vão ajudar no Teorema de Bayes, que expressa a probabilidade da hipótese 1, o trio verdadeiro, aquele indivíduo sendo testado ser o pai, em relação à hipótese 2, que é de qualquer individuo escolhido aleatoriamente na população ser o pai daquela criança, levando em consideração os dados genéticos e assumindo uma probabilidade a priori de 50%, de 0,5.

Na teoria, é convencionado usar essa probabilidade a priori de 50% para não haver a tendência de acusar o indivíduo de pai ou liberá-lo de ser pai. Então, utiliza uma probabilidade bem isenta.

Porém, na prática, essa probabilidade a priori não seria de 50%. Por quê? Se há provas testemunhais, documentais de que aquele cidadão teve uma relação estável com a mãe da criança, a probabilidade de ele ser pai da criança é muito maior do que a de qualquer individuo que nunca teve contato com essa mulher. Porém, não nos baseamos nesses dados, baseamo-nos apenas nos 50% para não tendenciar para nenhum lado.

Aqui, temos a fórmula: a probabilidade da evidência, levando-se em consideração as hipóteses 1 e 2, vezes a probabilidade a priori, que é a probabilidade sem a evidência, sempre de 50%.

Agora a tabela de um cálculo real de paternidade em que se utiliza a probabilidade a priori de 50%, chegando a uma probabilidade de paternidade de 99, 9999.

Há aqui uma variação de probabilidades a priori, e se pode ver que, quanto maior esta probabilidade a priori, maior será a probabilidade de paternidade, e vice-e-versa. Quando diminuímos essa probabilidade a priori vai cair, vai ter um decréscimo nesta probabilidade de paternidade.

Agora, vamos entrar diretamente na parte de paternidade. Três termos são bastante utilizados nos cálculos de paternidade. Índice de paternidade – IP -, que é a chance daquele homem ser o pai em uma só determinada região; índice de paternidade combinado, que é a força do nosso teste, é o produto de todos esses índices combinados, e a probabilidade de paternidade, que nada mais é do que aquela probabilidade a posteriori, levando em consideração esse índice de paternidade combinado.

O IP é o calculo da razão entre o numerador, que será o trio verdadeiro, hipótese 1, hipótese daquele pai testado ser o pai da criança, em relação a um denominador, que será a hipótese do trio falso, qualquer homem escolhido aleatoriamente ser o pai da criança, com exceção daquele pai testado e que não tem nenhum vínculo de parentesco com este pai testado.

Um caso prático do marcador de uma única região de teste, que é D8S1179, na mãe, há um alelo 1013; no filho, há o alelo 1315. Como já falado pela Simone, partimos da presunção de que a mãe é a mãe, ela registrou, ela está ali como mãe. Então, isola-se o alelo herdado pela mãe. Com isso sobra o alelo 15. Esse alelo é chamado de alelo paterno obrigatório e tem que estar presente no pai biológico desta criança.

Este pai testado aqui possui o alelo 15. Então, ele tem a chance de ser o pai, não estou dizendo que é o pai. Se não tivesse o alelo 15 já seria uma exclusão neste marcador.

Se ele tem chance de ser o pai, qual seria ela? Usamos a fórmula do IP. Se o pai é 9/15, tem dois alelos possíveis de passar para os seus descentes: 50% de passar o 9 e 50% de passar o 15. Neste caso, a chance de ele ser pai é de 0,5, 50%.

Qual é a chance de qualquer outro indivíduo da população ser o pai dessa criança? Qualquer outro indivíduo que tiver o alelo 15 poderá ser o pai dessa criança. Porém, não saímos testando todos os indivíduos na população. E como fazemos essa inferência? Por meio de tabelas de freqüência.

Esta tabela, por exemplo, foi publicado por nosso grupo que tem toda a distribuição alélica dos marcadores utilizados com mais de 12 mil indivíduos. Então, é uma população local, população do Rio Grande do Sul, que é bem específica para os nossos cálculos.

Aqui, para exemplificar, o alelo 15, que neste caso é o alelo paterno obrigatório, tem uma freqüência de 0,1254, o que significa que em torno de 12% da população do Rio Grande do Sul possui este alelo 15.

Voltando ao cálculo, a chance de qualquer indivíduo da população ser o pai daquele indivíduo testado é de 0,1254, o que nos dá um IP de 3,99, que significa que este pai testado tem 3,99 vezes mais chance de ser o pai do de qualquer outro indivíduo escolhido randomicamente na população. Isso é a chance.

Neste caso, temos a mesma mãe, o mesmo filho, o alelo paterno obrigatório, que é o 15, então já sabemos que a probabilidade de um outro indivíduo, fora o testado, ser o pai é de 0,1254.

Porém, houve uma modificação no suposto pai, ele é homozigoto, ele tem os dois alelos 15. Então, o alelo que lhe é possível passar para os seus descendentes é somente o 15. Assim, a chance de ele doar o alelo 15 para esse filho é de 100%, o que aumenta o nosso IP para 7,97, com a mesma interpretação, neste caso.

Outro caso: uma mãe 13/15 e um filho 13/15, sem ainda a identificação do alelo paterno obrigatório. O suposto pai tem o alelo 15, então, a chance de ele doar o 15 para o filho é de 0,5. Porém, a chance de outro indivíduo da população ser o pai aumenta, porque todos os indivíduos que possuírem o 13 e o 15 estão habilitados a ser o pai deste filho.

Então, a probabilidade de outro individuo da população ser o pai é a soma das freqüências dos alelos 13 e 15. Então, toda a população que tiver os alelos 13 e 15 está habilitada a ser o pai dessa criança, decrescendo muito o IP, 1,18.

Um caso comum, que chamamos de duo(?), ocorre quando existe ausência da mãe e é um pouco mais complicado, porque não há o isolamento do alelo paterno obrigatório, não se sabe qual é o alelo paterno nem o materno. Então, utilizamos os dados que temos: o suposto pai e o filho.

Sabemos que o pai tem que ter o 15 ou o 13. No caso, tem o 15, então, a probabilidade de ele passar o 15 para o filho é 0.5, 50%. Porém, essa probabilidade está condicionada à probabilidade de a sua mãe passar o 13. Como não temos os dados genéticos dela, usamos a probabilidade a priori de 50%.

Como a probabilidade de a mãe passar o 13 é 50% e a probabilidade de o pai passar o 15 também é 50%, essas duas estão condicionadas. Então, a probabilidade desse pai passar o 15, a mãe passando o 13 também, é de 0,5 vezes 0,.5.

Já a probabilidade de passar o 15, nesse cenário, é a mesma, porque estamos assumindo como alelo paterno obrigatório o 15, é da freqüência do 15, e nos dá um IP de 1,99.

Quero destacar que muitas vezes chegam, no laboratório, o suposto pai e o filho, dizendo que a mãe não foi intimada ou que a mãe não tem nada a ver com o caso, pois o caso é entre pai e filho, mas nós não aceitamos.

O caso 4 é igual ao caso 1, porém com a ausência da mãe. O caso 1 deu um poder de 3,99, ou seja, 3,99 vezes a chance de ser o pai. E aqui houve um decréscimo muito grande devido à ausência da mãe. Por isso, é essencial intimar a mãe para comparecer.

O IPC indica o poder da evidência genética, é a probabilidade da evidência, que vai dizer qual é a hipótese mais correta: a hipótese 1 ou a hipótese 2. No caso, assumimos o trio verdadeiro como hipótese 1, e o trio falso como hipótese 2.

Neste exemplo, usamos apenas 3 marcadores. Porém, num teste convencional de paternidade, usamos de 15 a 17 marcadores. Usando apenas 3 marcadores, o IPC - índice de paternidade combinado - deu que a hipótese 1 tem 21 vezes mais chances de ser verdadeira do que a hipótese 2.

Aqui temos a tabela de um laudo mostrando os índices parciais de cada marcador, ou seja, a chance em cada marcador isolado que nos dá um índice de paternidade combinado.

No caso, temos um índice maior do que 24 milhões.

Sobre a probabilidade da paternidade, ou seja, a probabilidade a posteriori, por meio de diversas simplificações, chega-se à fórmula de que a probabilidade é igual ao IPC sobre o IPC + 1. Nessa tabela podemos ver que o IPC de 100 dá uma probabilidade de paternidade de 99; de 1000, 99,9; de 10.000, 99,99; e de 100 mil, 99,999.

Aqui temos um dilema muito grande em falar em IPC – índice de paternidade combinado - e em probabilidade e paternidade, porque a maioria dos peritos está brigando para que a parte de probabilidade caia fora, pois pode ter-se uma interpretação errada.

Se olharmos 99,9 ou 99,91 ou 99,98, não vamos achar que a diferença é muito grande; porém, em termos de IPC, o 99,1 daria 1.100, por exemplo; o 99,98 daria um IPC de 9 mil, ou seja, o poder de um para outro é de quase 9 vezes no resultado. Então, o poder do teste é de quase 9 vezes mais. Porém, olhando apenas em termos de probabilidade, 99,91 e 99,98 não parece ter muita diferença.

Então, o cálculo de IPC zerou com a probabilidade de 99,99999, que é representado no laudo.

Quando se fala em suposto pai falecido a primeira lembrança é a exumação para colher-se um fio de cabelo, um pedaço de osso, um dente a fim de poder fazer o teste. Porém, quando o suposto pai é falecido a maioria das perícias é feita por meio da reconstituição, por meio dos parentes biológicos.

Então, por meio desses parentes biológicos se consegue remontar os dois alelos de cada marcador do suposto pai falecido. E essa remontagem, essa reconstituição total depende muito do número de parentes citados, do grau de parentesco deles e também da informação genética que eles apresentam. Com isso, podemos remontar, gerando um laudo conclusivo.




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