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04/12/2008

DMJ


FÓRUM DE PATERNIDADE

Fórum de Atualização em Investigação de Paternidade e DNA

Íntegra do conteúdo do evento, realizado em 04/12/2008
no auditório do Palácio da Justiça, em Porto Alegre

APRESENTADORA – Senhoras e senhores, boa-tarde. Na presença do Des. Arminio José Abreu Lima da Rosa, Presidente do Tribunal de Justiça do Rio Grande do Sul, e da Dra. Silvia Spalding, Presidente da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde – FEPPS – do Rio Grande do Sul, damos início ao Fórum de Atualização em Investigação de Paternidade e DNA.

Passamos a palavra à Dra. Silvia Spalding.

DRA. SILVIA SPALDING – Boa-tarde, senhores e senhoras. Cumprimento o Desembargador, agradecendo a sua presença; cumprimento os colegas da FEPPS aqui presentes, Dr. Alberto, Dr. Nicolella, que são os nossos interlocutores e fazem a operacionalização deste trabalho conjunto; cumprimento a Maria Lúcia Rossetti, Diretora do CDCT, nosso Departamento responsável pelas análises laboratoriais; e os outros Diretores da Casa.

Gostaria de externar a minha imensa alegria, porque, em março de 2007, quando fizemos este contrato de prestação de serviços com o Tribunal de Justiça e com a Defensoria, com a duração de cinco anos, havia algumas situações, no Estado do Rio Grande do Sul, que significavam uma fila de espera para as pessoas que necessitavam dessas análises. Estamos fechando este ano com 10 mil análises realizadas, fazendo com que essa fila de espera não se torne mais efetiva.

Fiquei muito contente, quando recebi a notícia de que a nossa Governadora, Yeda Crusius, assinou um projeto de lei, encaminhado à Assembléia Legislativa, para a contratação emergencial de técnicos a fim de serem feitas as análises laboratoriais, que significa o impacto e a união das nossas instituições em prol da saúde pública.

Então, trago aqui também a palavra do Secretário Estadual da Saúde, Dr. Osmar Terra, e também da nossa interlocutora junto à Assembléia Legislativa, Dra. Arita Bergmann, no sentido de que será aprovado com um acordo de lideranças em regime emergencial.

Assim, poderemos continuar, durante o tempo restante previsto no contrato, prestando um ótimo serviço aos senhores e à população necessitada do Estado do Rio Grande do Sul.

Hoje, este Fórum é necessário para atualização, verificando questões técnicas e científicas e congregando a área da Saúde com a do Judiciário.

Dentro disso, agradeço ao senhor, Desembargador, pela oportunidade de realizarmos este Fórum, no Tribunal, desejando um bom evento para todos.


APRESENTADORA – Convidamos a fazer uso da palavra o Presidente do Tribunal de Justiça do Rio Grande do Sul, Des. Arminio José Abreu Lima da Rosa.
DES. ARMINIO JOSÉ ABREU LIMA DA ROSA (PRESIDENTE) – Saúdo a Dra. Silvia Spalding, Diretora-Presidente da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde – FEPPS, o Dr. Omar Amorim, Diretor-Geral do Tribunal, o Dr. Alberto Naiditch, caríssimo Diretor do Departamento Médico do Tribunal, o Dr. Sílvio, nosso Juiz-Assessor da Presidência, assim saudando todos os participantes deste Fórum.

Para nós é um momento de muita satisfação assistir o congraçamento entre a área médica e a área judiciária nesta realidade tão expressiva à sociedade gaúcha. É com regozijo que o Tribunal de Justiça oferece este espaço para que pessoas tão dedicadas e tão abnegadas dentro das suas ocupações, que seguramente já lhes tomam tempo de trabalho, tempo de outros afazeres, inclusive do próprio lazer, dediquem-se a aprimorar os seus conhecimentos, as suas rotinas, obtendo, assim, um melhor resultado nessas atividades.

A Casa fica honrada em recepcionar este tipo de programa e dispõe-se a receber em outros eventos. É necessário aprimorarmos cada vez mais as nossas condições de trabalho, assim, é com satisfação que vejo, Dra. Silvia, estes números em relação a nossa atividade conjunta. E, conjuntamente com a Corregedoria-Geral de Justiça, estamos tomando outras iniciativas nesta área, visando a uma maior efetividade e celeridade em resolver questões envolvendo a definição de paternidade, que é algo vital ao ser humano não só na questão de seu íntimo, mas também na questão de sua dignidade.

Assim, congratulo a todos, esperando que tenham uma atividade profícua que não termine aqui, que prossiga em outros eventos.

Especialmente quero registrar ao Dr. Alberto Naiditch a minha satisfação e o meu reconhecimento com a atividade que vem prestando ao Departamento Médico do Tribunal.

Nós tínhamos algumas pendências em termos de perícias e definições vitais a pessoas, usualmente pessoas de condições muito humildes, muito modestas, o nosso estoque de perícias em algumas áreas mais complicadas já está praticamente zerado; em algumas, já zerou. Isso, em termos de repercussão social, é maravilhoso.

Então, mais uma vez, ao Dr. Alberto, aos médicos, aos odontólogos e aos demais funcionários do nosso Departamento Médico, o meu sincero reconhecimento e os meus cumprimentos pela atividade que este Departamento vem desenvolvendo.

A todos, desejo uma boa-tarde e uma atividade muito profícua neste evento.


APRESENTADORA – Neste momento, damos por encerrada a solenidade de abertura do Fórum e convidamos a Dra. Cláudia Maria Dornelles da Silva para proferir a primeira palestra do dia: Histórico e Evolução das Técnicas Utilizadas nos Testes de Paternidade.
DRA. CLÁUDIA MARIA DORNELLES DA SILVA – Boa-tarde, agradeço a presença de todos e a oportunidade de mostrarmos um pouco do que se realiza no Laboratório de Investigação de Paternidade.

Gostaria de iniciar dizendo que este laboratório fica no Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, que é um Departamento da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa, vinculado à Secretaria Estadual de Saúde.

A Presidente da FEPPS é a Silvia Spalding; o nosso Diretor-Técnico é o Alberto Nicolella, a quem eu gostaria de fazer um agradecimento especial, pois, além de grande amigo, grande Diretor, incentivou a realização deste fórum e organizou-o; a Diretora do CDCT é a Maria Lúcia Rosseti; eu sou a Coordenadora-Geral do Laboratório de Paternidade; a Coordenadora-Técnica do Laboratório é a Simone Schumacher, que falará em seguida.

A FEEPS situa-se na Av. Ipiranga, 5.400 e possui cinco Departamentos: o Laboratório Central, o Centro de Informações Toxicológicas, o Hemocentro do Rio Grande do Sul, o Laboratório Farmacêutico e o nosso Departamento, CDCT.

O CDCT é dividido em duas áreas. A área científica, onde realizamos pesquisas básicas e aplicadas nas áreas aqui definidas - doenças infecciosas, células-tronco, fármacos e doenças genéticas -, e a área de prestação de serviço, onde se enquadra o Laboratório de Investigação de Paternidade. Todo o trabalho desenvolvido dentro do CDCT obrigatoriamente tem que se enquadrar em normas de controle de qualidade e de biossegurança, inclusive há comissões que se destinam a fazer esse controle.

O CDCT possui áreas de trabalho separadas para evitar riscos de contaminação entre as técnicas utilizadas. Em todas as técnicas, que são basicamente de biologia molecular, temos o cuidado de aplicar controles que chamamos de positivos e negativos.

Nossas técnicas passam pela utilização de capelas de fluxo laminar, que realmente qualificam o trabalho.

Ainda para exemplificar o rigor existente, utilizamos, para cada técnica, jogos de pipetas automáticas reservadas a cada procedimento tendo como foco evitar contaminações.

Diante disso, procuramos implementar um rigoroso controle de qualidade com o objetivo - aí falando especificamente do Laboratório de Investigação de Paternidade - de manter a confidencialidade, a confiabilidade e a segurança dos resultados.

Mostra um desenho do prédio do CDCT, que está sendo construído atrás do Laboratório Central de Saúde, na Av. Ipiranga, onde está prevista a instalação do Laboratório de Investigação de Paternidade, e das dependências de recepção e coleta dos periciandos; uma fotografia, tirada em outubro, do prédio em construção, pois atualmente já está bem mais adiantado e espera-se que em abril esteja concluído e entregue a nós.

O Laboratório de Investigação de Paternidade iniciou a suas atividades, em junho de 2007, após um convênio celebrado entre o Poder Judiciário, a Defensoria Pública e a FEEPS, visando à investigação de paternidade e maternidade utilizando técnicas de DNA, beneficiando pessoas que têm assistência gratuita do Judiciário ou que são assistidas pela Defensoria Pública.

A nossa demanda gira em torno de 500 a 800 casos mensais, então, como a própria Dra. Silvia já mencionou, até o momento foram realizados aproximadamente 10 mil exames de investigação de paternidade. Os casos são típicos quando há a mãe, o filho e o suposto pai e atípicos quando o suposto pai é falecido, tornando a análise um pouco mais complexa.

Antes da entrada do Laboratório da FEEPS, em 2007, a demanda de processos de solicitação de investigação de paternidade resultava em uma fila de espera de 16 meses; atualmente, há cerca de 900 processos e uma fila de espera de cerca de 4 meses, que acredito que está diminuindo a cada dia. Ontem, liberamos um laudo em que a criança investigada nasceu em julho de 2008, o que dá a dimensão do quanto está tornando-se eficiente esta demanda.

O Laboratório conta com treze funcionários: um com doutorado, que sou eu, oito mestres e quatro técnicos. Contamos também com laboratórios de apoio no interior do Estado, onde postos de coleta nos encaminham o material.

Este ano, participamos do Programa de Controle de Qualidade Internacional pela Sociedade Internacional de Genética Forense, mais especificamente o Grupo JEP, que é um grupo conceituado internacionalmente nesta área, cujo site está ali demonstrado, e tivemos aprovação de 100% na prova realizada. Em 2009, esperamos continuar com essas provas.

Nesse ano também foi possível submeter o nosso trabalho à Revista Forense Science International, conceituada internacionalmente, e obter aprovação.

Aqui, uma imagem do Grupo coordenado por mim, que relatou as freqüências dos marcadores genéticos encontrados na nossa população.

Temos escutado de pessoas da área, até mesmo de fora do Estado do Rio Grande do Sul, que o nosso Laboratório de Investigação de Paternidade realmente está tornando-se um laboratório de referência pelo trabalho que vem desenvolvendo e que já somos o segundo laboratório do Brasil que mais realiza exames de investigação de paternidade - o primeiro é em São Paulo, o IMESC realiza, mensalmente, 6 mil exames de investigação de paternidade.

Contamos também com um grupo altamente qualificado, pessoas com experiência de mais de 14 anos na área. A Simone Schumacher iniciou aqui no Tribunal de Justiça ainda no tempo em que basicamente os marcadores utilizados eram os ABO – marcadores sorológicos. Atualmente, em função do grande número de investigações feitas, podemos compor uma tabela própria de freqüências alélicas, nossa tabela local, o que nos permite dar maior segurança aos cálculos que realizamos para cada laudo.

Utilizamos uma tecnologia de última geração com suporte da Empresa Applied Biosystem em que todos os kits, o software e o próprio analisador de DNA são certificados pela empresa.

E a nossa perspectiva para o próximo ano é implantar a assinatura digital e a consulta sobre o andamento dos exames via internet, nas quais estamos trabalhando.

Quero mostrar também uma foto do nosso grupo de pesquisadores jovens, porém experientes.

Mais especificamente sobre o assunto da minha palestra, histórico e evolução das técnicas utilizadas nos testes de paternidade, quero dizer que, desde os tempos bíblicos, há a questão da investigação de paternidade.

Desde 1890 começou-se a utilizar a pesquisa pelas digitais, mas essa metodologia, mais os antígenos eritrocitários, ABO, os antígenos leucocitários, HLA, foi sendo substituída pelas análises do ácido desoxirribonucléico, DNA - atualmente utilizada -, gerando, neste século, um grande avanço e sendo considerada uma das mais importantes questões na área de investigação forense.

Um breve histórico sobre quando se começou a pesquisar os marcadores que foram sendo depois utilizados e aplicados na área. Em 1900, Landsteiner descobre o sistema ABO, que, em 1910, já passa a ser aplicado na utilização de teste de paternidade. Em 1927, descobre-se o sistema MN. Em 1940, descobre-se o fator RH. E todos eles foram sendo agregados também como marcadores que possibilitariam reunir informações de individualidade. Esses sistemas têm deficiências, mas, mesmo assim, foram úteis para a ocasião e foram utilizados até 1960.

Obviamente esses grupos sanguíneos utilizados trouxeram um grande avanço nessa área. A utilização do sistema ABO exclusivamente não tem um poder de discriminação muito alto – 55% -, mas a agregação de outros marcadores possibilitou um aumento das freqüências de poder discriminatório de um suposto pai. Porém, mesmo assim, podia dizer-se que essa freqüência dava a indicação de uma provável paternidade ou de uma muito provável paternidade. Com a introdução do DNA, pode falar-se em extrema probabilidade de paternidade quando se atinge a casa de 99,9%, por exemplo.

Esses sistemas, na verdade, foram extremamente úteis para excluir, ou seja, no caso de exclusão de acusação de supostos pais, mas, sozinhos, tinham baixo poder discriminatório.

A implementação das técnicas de investigação de DNA foi agilizada com o começo do projeto Genoma Humano, em redor de 1990, com a automação de seqüenciadores de DNA. Hoje, essa tecnologia nos permite dizer que a análise por DNA possui vantagens sobre os outros sistemas, pois admite a utilização de vários tipos de amostras biológicas de diferentes ordens de um indivíduo - cabelo, sangue, pele – que permitem a extração do DNA, além de, devido à alta sensibilidade das técnicas, a quantidade da amostra biológica analisada poder ser extremamente pequena e o potencial discriminatório ser muito grande - na ordem de 99,99999% -, exceto quando o caso é de gêmeos idênticos em que não há como distingui-los.


Além disso, o DNA apresenta relativa resistência a agressões do meio-ambiente, quer dizer, mesmo depois de algum tempo fora do corpo, na cena de um crime, por exemplo, pode-se tentar recuperar essa molécula que fica dentro do núcleo das células de uma amostra biológica.

Na verdade, tudo começou com a descoberta do Dr. Alec Jeffrey, em 1985, pois ele foi o primeiro a utilizar a tecnologia com esse propósito.

Há vários tipos de amostras biológicas das quais se pode extrair o DNA.

Mostra uma imagem. As regiões que utilizamos são chamadas STRs, short tanden repeats, e são regiões do genoma humano que têm um alto grau de variação entre os indivíduos. Na realidade, são regiões repetitivas não-codificadoras - demonstradas aqui de maneira simplificada com as bases do DNA - que nos permitem fazer análises que diferenciam um indivíduo do outro.

Essa é a minha mensagem. Muito obrigada.

Agora, gostaria de passar a palavra ao Dr. André Gastaldo.


DR. ANDRE GASTALDO – Boa-tarde a todos. Apresentarei, Juntamente com a Dra. Simone, as técnicas utilizadas atualmente na investigação de paternidade pelo nosso laboratório, descrevendo rapidamente a forma de colheita de material biológico, a extração e a amplificação de DNA, a genotipagem sempre enfocando os pontos em que há controle de qualidade afetando diretamente na confiabilidade do exame.

Na verdade, a identificação começa no laboratório onde as partes envolvidas apresentam documentos de identidade com foto. A partir desse momento, junto com um ofício correspondente às informações do processo, é preenchida uma ficha de autorização de coleta de material biológico, onde são informados os dados das partes envolvidas, baseados nos documentos de identificação apresentados, destacando-se o número do processo, a comarca onde está ocorrendo a investigação, sendo-lhe atribuindo um número, que corresponderá ao laudo emitido após a análise.

É importante salientar que a colheita de material biológico só é realizada a partir do momento em que todas as partes intimadas que serão periciadas se encontrarem.

Ressalta-se a importância de todas as partes estarem presentes ao mesmo momento - no mesmo local e na mesma hora -, pois isso serve de reconhecimento mútuo e de auxilio ao perito para confirmar o objeto da ação, se aquelas pessoas que estão ali são realmente as que devem ser investigadas, inclusive propiciando às partes envolvidas testemunharem a correta realização do procedimento de colheita, possibilitando a verificação da ocorrência de algum tipo de eventualidade, de alguma troca por parte de quem está realizando a coleta.

Porém, antes de realizar-se a colheita, o perito faz algumas perguntas de grande importância, que serão destacadas posteriormente. É perguntado sobre a ocorrência de transfusão sangüínea - se houve transfusão sangüínea recente, transplante de medula óssea -, e se existe algum grau de parentesco entre as partes. Qualquer resposta afirmativa deve constar como observação na autorização para posterior análise, caso ocorra algum problema. Porém, nenhuma resposta afirmativa impede a realização da colheita e a investigação de paternidade.

Após a explanação do perito sobre o exame a ser realizado, falando sobre o prazo e o local de entrega do laudo pericial, em espaço destacado, as partes, cientes de que a investigação será realizada, e o perito assinam. Ele assinará declarando que é responsável pela identificação das partes presentes e garantindo a esterilização e o destino apropriado do material colhido.

O material de escolha do nosso laboratório é o sangue, coletado a partir de uma punção digital - na ponta do dedo ou na planta do pé no caso de recém nascidos.

Assim, uma gota de sangue é fixada num cartão. Esse procedimento apresenta muitas vantagens se comparado à coleta de sangue em tubos com vácuo. Ele apresenta uma rápida secagem e é menos invasivo que a punção venosa, que pode gerar algum trauma, porém apresenta igual eficácia quando submetido à análise, não havendo nenhum tipo de restrição quanto a seu uso, apresentando ainda maior segurança no transporte, pois não são necessários grandes recipientes. Quer dizer, o transporte, após a secagem da amostra, é bem simples de fazer.

Mostra a foto de uma microscopia eletrônica onde se percebem fibras maiores - são as fibras do papel -, e os cristais dos reagentes específicos desse cartão prontos a entrarem em ação assim que uma substância entrar em contato.

O cartão de coleta é preenchido anteriormente à realização do procedimento, as partes são chamadas pelo nome, a lanceta é acoplada no lancetador em frente das partes para que haja segurança e confiabilidade de que está sendo utilizado material novo, é feita uma pequena pressão na ponta do dedo para concentrar o sangue e, a partir da introdução da lanceta no dedo, já saem gotas de sangue que são pingadas em espaços destacados de cada parte da investigação. Elas são colocadas em estantes apropriadas para a secagem do sangue, e a amostra está pronta para ser analisada.

Mostra outra foto de microscopia eletrônica daquele papel especial em contato com o sangue - aponta uma hemácia - e das reações químicas que já começam a ocorrer, lisando(?) as células, liberando o seu conteúdo. As células nucleares começam a liberar o DNA, prontas a seguir para o próximo procedimento, que é a extração do DNA, porém, para que ocorra o controle de qualidade e a verificação de que a identificação e a investigação estão sendo realizadas de forma correta, é sempre feita a conferência de todos os dados colhidos: número do processo; comarca; nome completo de acordo com o documento de identificação; se cada parte envolvida tem a sua sigla; se o seu status está correto na investigação - mãe, filho, suposto pai ou outro tipo de parentesco quando é de suposto pai falecido -; se a assinatura das partes e do perito consta na autorização. Depois disso é conferido se há algum tipo de problema na amostra, se houve alguma mistura de sangue ou qualquer problema que possa interferir na análise.

Não ocorrendo qualquer problema, as amostras são liberadas para a extração de DNA, que é realizada nestas placas de 96 poços. Em média, realizamos 30 casos de investigação de paternidade - casos de trios: mãe, filho e suposto pai – simultaneamente. Para um maior controle e identificação de qual amostra está em cada poço, utilizamos o que chamamos de espelho, que nada mais é do que o desenho da placa mostrada anteriormente onde consta cada amostra em cada poço que podemos localizar. E elas servirão de modelo até o final da investigação; até a parte da aplicação, elas estarão em cada poço.

Também, como forma de controle, os responsáveis ou o responsável por cada procedimento é responsável pela extração, pela amplificação e depois pela aplicação das amostras porque, no caso de haver algum problema, se verifica com o responsável o ocorrido.

Mostra a imagem de um picotador, que é semelhante a uma caneta, fazendo um pequeno picote - aproximadamente 1,2mm de diâmetro - na mostra de sangue colhida. Embora ele seja muito pequeno, é suficiente para fazer a análise e, dependendo do protocolo de extração, pode até possuir uma quantidade maior de DNA do que a necessária.

Como já havia comentado, as amostras ficam alocadas nos respectivos poços, dos quais só são retiradas quando forem aplicadas no seqüenciador automático, garantindo menos transporte ou mudança de recipientes, o que evita contaminações e possíveis trocas de amostras.

O método de extração do DNA é bem simples. Com um detergente da mesma marca do cartão são feitas duas lavagens de 15 minutos para a retirada de sujidades e de outros componentes celulares que não interessam, depois é feita uma lavagem com água desmineralizada e estéril e finalmente é feita a secagem dessas amostras em um termobloco a 60º, estando as amostras aptas para a análise. Desde a seleção das amostras até o resultado final da extração, o tempo é de aproximadamente duas horas. Demonstramos aquele mesmo cartão agora somente com a fibra de papel e este emaranhado, que são as moléculas de DNA prontas para serem processadas e amplificadas.

Porém, não se analisa todo o DNA, não é necessário analisar todo o DNA, somente alguns fragmentos específicos são selecionados, e, para amplificá-los, é utilizada a técnica de PCR, praticada por todos os laboratórios de biologia molecular. Essa é uma técnica muito sensível e específica que amplifica múltiplas cópias de determinados fragmentos do DNA. Nesta imagem, as regiões amplificadas são os loci.

A técnica de PCR Multiplex nada mais é do que o mesmo PCR, porém diversas regiões do DNA são amplificadas simultaneamente. Os loci amplificados são os marcadores genéticos selecionados por apresentarem alto polimorfismo, e nada mais são do que diversas formas entre a população validadas internacionalmente que apresentam herança genética, herança mendeliana e de baixa mutação.

Esses marcadores genéticos são os STRs, que são seqüências repetitivas em determinadas regiões de DNA, e os alelos são os números de repetições que essas seqüências apresentam.

Mostra a imagem de uma seqüência de quatro nucleotídeos que são repetidas três vezes e assim sucessivamente, e isso que irá determinar o alelo de cada marcador.

O Kit Identifiler, da Applied Byosystem, de identificação humana, utilizado prioritariamente no laboratório, contém 15 marcadores genéticos, incluindo os 13 aconselhados pelo CODES(?) e mais a amelogenina, que determina o cromossomo sexual.

Porém, além dele, utilizamos o Kit PowerPlex da Promega, mais o Kit Yfiler da Applied Byosystem juntamente com o Kit SEfiler que foi recentemente introduzido na rotina do laboratório.

Apenas exemplificando, todos os marcadores do Kit Identifiler e a sua localização nos 22 cromossomos autossômicos. Normalmente o nome do marcador corresponde ao cromossoma em que ele se localiza, por exemplo, o D2 no cromossomo 2.




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