Adriane Moro Mendes Professora de Microbiologia Camila Carvalho Kessler



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Aulas Práticas de Microbiologia



para Odontologia



Florianópolis- SC


2003


Adriane Moro Mendes


Professora de Microbiologia


Camila Carvalho Kessler






Aluna da Graduação de Odontologia




Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC


Centro de Ciências Biológicas – CCB
Departamento de Microbiologia e Parasitologia - MIP



Índice

Aula I: Normas de segurança no trabalho ............................................................ 03

Aula II: Esterilização e Desinfecção .................................................................... 04

Aula III: Microscopia a Fresco .............................................................................. 11 Aula IV: Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura ....................................... 13

Aula V: Microscopia de Gram .............................................................................. 17

Aula VI: Antibiograma ......................................................................................... 19



Aula VII: Pesquisa de Microrganismos na Escova Dental ................................ 22
NORMAS DE SEGURANÇA NO TRABALHO NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos uma variedade de bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem, portanto é essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais.


  1. O uso do guarda-pó é obrigatório.

  2. Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos.

  3. Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática.

  4. Lavar e sanificar as mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material.

  5. Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise.

  6. Utilizar exclusivamente material estéril para a análise.

  7. No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes.

  8. Não comer, beber ou fumar no laboratório.

  9. Manter canetas, dedos e outros longe da boca.

  10. Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.

  11. Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.

  12. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-os sobre a bancada.

  13. Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso.

  14. Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia.

  15. Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis por perto.

  16. Trabalhe sempre próximo ao fogo.


O

Figura 1

BS:
A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

Aula Prática II: Desinfecção e Esterilização

ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos.
DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local.
ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local.
ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por exemplo, através do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal.
LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização.

I- ESTERILIZAÇÃO:
A esterilização é o processo que inativa todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente, portanto é o método indicado para uso em itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminação, classificados como “críticos”, ou seja, aqueles que durante o atendimento odontológico penetrarão em pele e mucosa, ou serão introduzidos diretamente na corrente sangüínea, sendo portanto de alto risco (p. ex. sonda exploradora, sonda periodontal, gaze, fios, campos, tesouras, etc.)

A melhor maneira de garantirmos a destruição de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que causam infecções em seres humanos desenvolvem-se em temperaturas próximas a do corpo, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que não acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo fica apenas inibido, e não é destruído.

Alguns microrganismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio inicial de infectividade. Portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os esporos.

Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Mas definitivamente os métodos de esterilização mais empregados em odontologia são os que utilizam o calor, seja este úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor úmido (autoclave) é melhor.


I.1- Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)
Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos microrganismos.

A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.

Para ser eficiente, este processo depende de:

- Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do material.

- Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados.

- A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre as caixas.

- O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.

I.2- Esterilização pelo Calor Úmido

O calor úmido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais através das formas de: vapor d’água, água fervente e água aquecida abaixo de seu ponto de ebulição.




  • Água fervente

É a água levada ao ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os microrganismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados não são esterilizados com segurança pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora.


  • Vapor d’água

O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco.

A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos microrganismos, e por este motivo é mais rápido.

Funcionamento da autoclave:


  1. A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar;

  2. É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d’água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave;

  3. A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol² , na qual a temperatura do vapor é de 121ºC.

A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores:

  • Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados.

  • O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é atingida.

  • A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual.

  • Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado.



Controle da Esterilização

É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia, conhecimento da pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente.

O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do processo.

Este controle deve fazer parte da rotina do consultório para garantir a saúde dos pacientes e de toda a equipe.


Considerações importantes





  1. É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita dos instrumentais antes de serem submetidos à esterilização. A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus, sangue, e outras secreções) protege o microrganismo da ação esterilizante. É adequado lavar manualmente os instrumentos com detergente e água morna antes da esterilização.

  2. Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrário voltam a se recontaminar com microrganismos presentes no ambiente.

  3. Estudos recentes mostraram que os termômetros e termostatos embutidos na estufas em consultórios odontológicos não são confiáveis, portanto, sugere-se que sejam utilizados termômetros calibrados de acordo com as especificações do INMETRO. Se não for possível, deve-se considerar que o termômetro de mercúrio tem uma incerteza na medição da faixa de 5ºC a 10ºC.

  4. Deve-se realizar o controle periódico da qualidade do processo, através de profissionais preparados para tal procedimento.



II- DESINFECÇÃO

Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química (Desinfectantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de microrganismos inativados.



  1. Desinfecção de alto nível: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. Este tipo de desinfecção é indicado para itens classificados como “semi-críticos”, ou seja, que entram em contato com mucosas íntegras e pele não íntegra (p. ex. abridor de boca, condensadores de amálgama, espátulas para inserção de resinas, etc.)

  2. Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa bactérias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vírus. É indicada para uso em itens classificados como “não-críticos”, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele íntegra. (p. ex. estetoscópios, termômetros, esfigmomanômetros, gorro, máscara, refletor, etc.)

  3. Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus. É indicada também para itens de uso “não-crítico”.


II.1- Desinfecção por agentes físicos:


  • Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C)

Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células vegetativas de microrganismos, mas não os esporos, portanto, é um método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos.
II.2- Desinfecção por agentes químicos:

11.2.a) Método de Desinfecção de alto nível:


  • Glutaraldeído: é indicado qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos.

  • Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa.

  • Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos.

  • Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos.


11.2.b) Método de Desinfecção de nível intermediário:


  • Compostos Clorados: Causam a inibição de reações enzimáticas intracelulares, desnaturação de proteínas, e inativação de ácidos nucléicos.Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida (ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos.

  • Álcoois(Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% peso por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra-indicado para materiais médico-cirúrgicos, borracha, plásticos e acrílico.

  • Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular, precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,4-5% sendo que o tempo de exposição deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso é indicado para descontaminação de ambiente hospitalar, itens cirúrgicos e médicos não-críticos, sendo que devem ser consideradas as limitações devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia – crianças – berçários), e ação residual em materiais porosos.

  • Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos.


11.2.c) Método de Desinfecção de baixo nível


  • Álcoois

  • Compostos Clorados

  • Fenólicos: em concentração menor que 5%

  • Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm

  • Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas, desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies)

  • Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex. Quaternários de Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e lípases, e,portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras (ex: Endozime)


Principais Compostos Utilizados em Desinfecção e Assepsia




Agente

Espectro de ação*

Uso

Modo de ação

Tempo de exposição

Desvantagens

Álcoois (70-80%)

Gram-positivas Gram-negativas BAAR**

Antissépticos Desinfectantes

Desnaturação protéica dissolução de lipídeos

Curto (10-15 min)

Pouco ativo contra esporos

Fenóis

Gram-positivas Gram-negativas BAAR

Desinfectantes

Desnaturação protéica

Efeito imediato

Fenol puro é corrosivo e de odor desagradável

Compostos Quaternários de amônio

Gram-positivas Gram-negativas

Antissépticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirúrgicos)

Alteração da membrana celular bacteriana

Curto (10-30 min)

Não age sobre BAAR e esporos

Cloro

Gram-positivas Gram-negativas BAAR

Tratamento da água

Inativação enzimática agente oxidante

Efeito imediato

Odor irritante pouco ativo contra esporos

Iodo

Gram-positivas Gram-negativas BAAR

Antissépticos Desinfectantes

Inativação enzimática

Efeito imediato

Odor irritante pouco ativo contra esporos

Iodóforos

Gram-positivas Gram-negativas BAAR

Antissépticos Desinfectantes

Inativação enzimática

Efeito imediato

Pouco ativo contra esporos

Aldeídos***

Gram-positivas Gram-negativas BAAR

Desinfectantes (instrumentos e superfícies)

Desnaturação protéica agente alquilante

Curto (formas vegetativas) Prolongado (esporos)

Tempo de exposição longo

Metais pesados

Gram-positivas Gram-negativas

Antissépticos

Inativação enzimática

Só agem enquanto em contato

Não atuam sobre BAAR e esporos

*- Formas vegetativas; Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991.

**- Bacilos álcool-ácido resistentes;

***- Ativos contra esporos

Técnica I: O experimento que será realizado tem por objetivo verificar a ação de antissépticos sobre a microbiota das mãos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas:
1- Pegar uma placa de Petri contendo ágar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a divisão na parte de baixo da placa.
2- Identificar cada quadrante com os respectivos títulos: Controle (C), Mão Suja (MS), Detergente (Det), Álcool 70% (A), e Álcool Iodado (AI ). Devem ser preparadas 2 placas seguindo o esquema abaixo.

3- No quadrante identificado como “ Mão Suja” o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no ágar por 1 minuto.

4- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mãos com detergente, secá-las levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “Detergente” por 1 minuto.

5- O mesmo aluno deve então lavar as mãos com álcool, secá-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “álcool” por 1 minuto.

6- A placa deve ser levada para incubação.
OBS: Nada deve encostar no quadrante identificado como “Controle”.
Técnica II: Este procedimento tem por finalidade observar a efetividade do processo de esterilização por autoclave, através da comparação entre material contaminado levado para o processo de esterilização e aquele que não passa por esse processo.
1- Retire um fio de cabelo (ou um pedaço de unha), e divida o material em duas partes.

2- Coloque uma parte do material em cada tubo de ensaio.

3- Identifique os tubos, destinando um para a autoclave (A) e o outro para a estufa (E).

4- O tubo E deve ser imediatamente incubado.



5- O tubo A deve ser encaminhado a autoclave, sendo a seguir também incubado (pela equipe de técnicos do departamento).
Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.



  1. Faça uma representação esquemática dos resultados obtidos na avaliação da microbiota das mãos.





Crescimento Bacteriano


-

+

++

+++

++++

Placa I

Controle
















Mão Suja
















Detergente
















Álcool 70%
















Placa II

Controle
















Mão Suja
















Detergente
















Álcool Iodado

















  1. Como você interpreta os resultados obtidos? Qual a importância da antissepsia das mãos na odontologia?

Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________


Nome do(a) professor(a): _________________________________________________________

Aula Prática III: Microscopia a Fresco


Sabemos que as bactérias são seres microscópicos, portanto a sua observação direta depende do uso do microscópio. Essa observação pode ser feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem coloração.

A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural das bactérias e atividades celulares como a motilidade bacteriana.

A respeito da motilidade é possível observar dois movimentos: o movimento flagelar, que é ativo e característico de bactérias dotadas de flagelos, e o movimento browniano, o qual é passivo e ocorre na direção das correntes líquidas que se formam nas preparações.



Técnica: Será utilizada a técnica denominada Gota Pendente, na qual o inóculo fica suspenso em uma lâmina escavada (lâmina de Koch).


  1. Retire com uma alça esterilizada uma gotícula da cultura-teste.

  2. Deposite esta gotícula no centro de uma lamínula previamente limpa e seca.

  3. Coloque um pouco de vaselina nas bordas da concavidade da lâmina escavada, também limpa e seca.

  4. Inverta a lâmina côncava sobre a lamínula de forma que a gotícula ocupe o centro da concavidade.

  5. Inverta novamente a posição da lâmina, de forma que a gotícula fique pendente no centro da concavidade.

  6. Leve a preparação ao microscópio e focalize a gota com objetiva de 40x com luz reduzida (as bactérias possuem índice de refração próximo ao da água).

Diferencie os dois tipos de movimento: ativo (flagelar) e passivo (browniano). O movimento flagelar é caracterizado pelo deslocamento, pela mudança da posição da bactéria, enquanto que o browniano não acarreta mudança na posição, não há deslocamento autônomo da bactéria.

Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.




  1. Desenhe o que foi visualizado na observação direta de microrganismos, exemplificando o movimento observado.






  1. Qual é a finalidade da utilização da técnica de gota pendente?

Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________


Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________

Aula Prática IV: Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura


Meios de Cultivo

Os meios de cultivo, também chamados meios de cultura, são complexos que se destinam ao cultivo artificial de microrganismos.

As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes microrganismos nos meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas:


  • crescimento bacteriano;

  • isolamento bacteriano;

  • estudo da morfologia colonial;

  • pesquisa de patogenicidade;

  • pesquisa das características bioquímicas.

Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias para o seu crescimento e multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento.

Classificação dos meios de cultivo:
- Quanto à consistência:


  • Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja o meio sofre uma turvação.

  • Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacarídeo proveniente de algas marinhas, chamado ágar. São geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana.

  • Meios sólidos: são aqueles que possuem uma porcentagem maior de ágar (cerca de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em ágar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de microrganismos.

- Quanto à função:



  • Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microrganismos pouco exigentes. Ex: caldo simples.

  • Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Ágar sangue.

  • Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. Ex: Ágar Salmonella-Shigella.

  • Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de microrganismos com características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex: Ágar MacConkey.

  • Meios de manutenção: são aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: Ágar Nutriente.

-Quanto à natureza:



  • Meios animados: são constituídos de células vivas, como animais de laboratório, tecidos vivos ou ovo embrionado.

  • Meios inanimados: não possuem células vivas. Podem ser naturais ou sintéticos. Naturais são aqueles que possuem substâncias provenientes da natureza, e o sintético contém substâncias obtidas em laboratório. Ainda podemos obter meios de cultivo semi-sintéticos, que são resultantes da união dos dois anteriores.

Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.



Técnica de Semeadura

A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras devem ser seguidas nas inoculações:



  • A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado de esfriá-las antes da coleta.

  • Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen.

  • Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo.

Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o ágar, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar as condições de crescimento bacteriano.



Técnica I: Meio Líquido


  1. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

  2. Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a alça.

Figura 1



Técnica II: Meio semi-sólido


  1. Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é fornecida.

  2. F

    aça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-sólido.


Figura 2



Técnica III: Meio sólido (ágar inclinado)


  1. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

  2. E
    ncoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfície do ágar.


Figura 3


Técnica IV: Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento)


  1. Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da placa.

  2. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

  3. Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda a superfície da placa.




Figura 4


Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.





  1. Cite os três tipos de meio de cultivo utilizados na aula prática e suas finalidades.




  1. Qual a finalidade do cultivo em meio sólido em placa através de estrias de esgotamento? Explique.



  1. Como se analisa o resultado obtido no crescimento do meio semi-sólido?

Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________

Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________

Aula Prática V: Microscopia de Gram
A parede celular de bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-negativas pela presença de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede celular é a base da coloração de Gram, uma técnica primordial no diagnóstico microbiológico, visto que através dela se definem características morfológicas e tintoriais da bactéria em pesquisa.

A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). O cristal vioeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere coloração roxa tanto pelas bactérias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas. Com a adição de álcool-acetona, as bactérias Gram-negaticas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano é de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retêm o complexo, permanecendo roxas. A adição de fuccina (ou safranina) não altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactérias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo álcool-acetona.



Técnica:
-Esfregaço da cultura bacteriana líquida:

  1. Flambe uma alça, deixe esfriar, mantendo-a próximo a chama.

  2. Retire uma amostra da cultura com a alça e deposite no centro da lâmina.

  3. Espalhe o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.

  4. Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

-Esfregaço de cultura bacteriana sólida:



  1. Flambe uma alça, deixa esfriar, mantendo-a próximo a chama.

  2. Retire uma gota da água estéril e deposite sobre a lâmina.

  3. Flambe novamente a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura sólida.

  4. Leve a amostra até a gota de água depositada sobre a lâmina, e homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.

  1. Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

- Adição de Corantes:



  1. Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte.

  2. Cubra a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto.

  3. Lave a lâmina em jato fraco de água corrente, do lado contrário ao esfregaço.

  4. Cubra a lâmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lâmina.

  5. Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona (Gram III), verifique a descoloração que deve ocorrer em cerca de 20 segundos.

  6. Cubra a lâmina com fuccina Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lâmina.

  7. Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e a seguir seque o restante da lâmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse “cortando” a chama).

  8. Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não esqueça de colocar uma gota de óleo para imersão sobre o esfregaço)

OPara ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.


  1. Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia bacteriana e a reação tintorial.






  1. Fale sobre o fundamento da técnica de Gram.

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Aula Prática VI: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)
Antibiogramas são bioensaios conduzidos “in vitro” que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. A proposta primária deste teste é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para a terapia. Os testes de rotina fornecem dados acumulados, que são informações sobre os agentes para uso empírico. Além disso, estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).

1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.

2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns fatores são essenciais:


  • Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.

  • Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias, devendo-se realizar a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-Farland).


Técnica:
Para cumprir os objetivos desta aula será utilizado o método de difusão:


  1. S

    SWAB
    ature um swab de algodão com a suspensão bacteriana (Fig 1). Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.

  2. S
    Figura 1

    emeie a suspensão sobre a superfície estéril de uma placa contendo ágar Muller-Hinton, utilizando sucessivamente três direções para obter um inóculo uniformemente espalhado sobre toda a superfície do ágar ( Fig 2 ).

Figura 2




  1. Distribua cinco discos de antibiótico, sendo cada um de um antimicrobiano diferente, sobre a superfície do ágar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). Deixe uma distância de aproximadamente 1 cm entre a borda da placa e o disco.


Figura 3




  1. Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a incubação.

  2. Incube as placas por 24 horas a 37°C.



Análise dos Resultados


A


Figura 4

través da análise dos resultados poderemos classificar os microrganismos testados em: “resistente”, “intermediário”, “moderadamente sensível”, e “sensível”, dependendo da formação ou não de halo inibitório e também de seu diâmetro(Fig 4).

No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5) . De modo geral, estas tabelas determinam medidas de diâmetro, e dessa forma a medida encontrada em cada caso pode então ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas.

FIGURA 5: Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade


Antimicrobiano

Código

[µg]

Halos de Inibição (mm)

Resistente

Intermediário

Moderadamente sensível

Sensível

Bacitracina

BAC

10

< 8

9 a 12

-

> 13

Cefotaxima

CTX

30

< 14

-

15 a 22

> 23

Gentamicina

GEN

10

< 12

13 a 14

-

> 15

Tetraciclina

TET

30

< 14

15 a 18

-

> 19

Vancomicina

VAN

30

< 9

10 a 11

-

> 12



EXEMPLO: Se para um determinado microrganismo, utilizando-se o antimicrobiano Gentamicina, foi medido o diâmetro de um halo de inibição e constatou-se que este era de 16 mm, tal microrganismo deve ser classificado como sensível para a Gentamicina. Entretanto se o diâmetro do halo fosse de 13 mm o microrganismo seria classificado como intermediário a Gentamicina. No caso de não formação de um halo de inibição, o microrganismo seria considerado resistente.

OPara ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.




  1. Descreva os resultados obtidos, indicando qual a bactéria utilizada, a formação ou não do halo de inibição para cada antimicrobiano utilizado, indicando o tamanho do halo, caso este tenha se formado, e a classificação da bactéria a respeito de sua sensibilidade a cada antimicrobiano.

2- Explique como se forma um halo de inibição.

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Aula Prática VII : Contagem de Microrganismos na Escova Dental
A cavidade bucal é um ambiente densamente povoado por microrganismos. Portanto considerando o íntimo contato da escova dental com tal ambiente é de se imaginar que este objeto de higiene pessoal seja especialmente contaminado com os diversos tipos de microrganismos que habitam a cavidade bucal.

O experimento a ser realizado, tem por objetivo a verificação da presença de microrganismos na escova dental, através de procedimentos quantitativo (contagem) e qualitativo (coloração de Gram).


Técnica:


  1. Mergulhar a escova dental em balão ou erlenmeyer com caldo nutritivo estéril (trabalhe próximo à chama do Bico de Bunsen).

  2. Agite a solução por 5 minutos.

  3. Retire a escova.

  4. Faça a diluição, retirando, com auxílio de uma pipeta esterilizada, 1ml da solução e transferindo para um tubo contendo 9 ml de solução salina.

  5. Agite bem o tubo.

  6. Repita os procedimentos 4 e 5 para cada nova diluição sempre pegando uma amostra de 1 ml da última solução preparada, e não esquecendo de a cada nova diluição utilizar uma nova pipeta esterilizada.

  7. Retire 0,1 ml, utilizando uma pipeta esterilizada, da solução com diluição de 10-1.

  8. Espalhe por toda a superfície da placa de ágar, utilizando a alça de Drigalski (de vidro).

  9. Repita os procedimentos 7 e 8 para as diluições de 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5 , não esquecendo de identificar as placas com as diluições correspondentes a cada uma.

10- Leve as placas para incubar.




Análise dos Resultados



1- Análise quantitativa:
O objetivo desta análise é determinar o número de bactérias por ml, para isso:
- Selecione uma das placas incubadas, que contenha entre 30 e 300 colônias;

- Conte o número de colônias;

- Calcule, no espaço abaixo reservado, a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte fórmula:


UFC* = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem)



* UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma vez que a contagem feita é referente às colônias e não às células presentes.

** 10 é um fator de correção.
EXEMPLO:

Se são contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita diluição de 10-2 , o cálculo final será:


UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/ml

2- Análise dos microrganismos através do método de Gram.
O objetivo desta análise é verificar o tipo de microrganismos presentes segundo: forma, arranjo e reação tintorial (Gram positivo ou Gram negativo).
- Com a alça esterilizada, retire uma gota do tubo de ensaio com água destilada e deposite sobre a lâmina.

- Com a alça esterilizada, retire 2 a 3 colônias da placa com as culturas bacterianas.

- Leve a massa bacteriana até a gota previamente depositada sobre a lâmina, e misture com movimentos circulares, formando um esfregaço de forma aproximadamente oval.

- Seque a lâmina na chama do bico de Bunsen.

- Core a lâmina, através do método de Gram. (siga as instruções da Técnica de adição de corantes, pág. 16).

CÁLCULO DA UFC


OPara ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.




  1. Calcule a quantidade de microrganismos (UFC), seguindo as instruções da Análise Quantitativa, dos cultivos feitos a partir de microrganismos da escova dental.



  1. O que se pode concluir a respeito da quantidade de microrganismos encontrados na escova dental ?



  1. Utilizando o método de Gram, quais os tipos bacterianos foram predominantemente observados dentre os microrganismos encontrados na escova dental?

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